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【摘要】目的：探討不同海拔的高原地區(qū)嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇后肺組織細(xì)胞凋亡及其基因調(diào)控機(jī)制.方法:雄性Wistar大鼠240只,分別在1517m和3848m海拔高度隨機(jī)分為延遲復(fù)蘇組(DFR,n=50),即時(shí)復(fù)蘇組(IFR,n=60)和對(duì)照組(n=10),建立總體表面積30%的Ⅲ度燙傷模型,分別于傷后1,6,12,24,72和168h取材.采用組織病理學(xué)、組織芯片技術(shù)、原位末端標(biāo)記（TUNEL）法、免疫組織化學(xué)染色與圖象分析技術(shù),觀察肺組織病理學(xué)改變與細(xì)胞凋亡及Bcl2和HIF1α的表達(dá).結(jié)果:隨海拔的增加,肺泡壁明顯增厚,毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹,肺泡腔中出現(xiàn)水腫液且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),DFR組較IFR組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),肺泡上皮細(xì)胞凋亡逐漸增多,各海拔高度DFR組均較IFR組變化大(P<0.05).Bcl2與HIF1α的陽(yáng)性表達(dá)均位于肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞核或胞漿,其表達(dá)強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組(P<0.05),隨海拔梯度上升Bcl2表達(dá)增強(qiáng),各海拔高度DFR組Bcl2表達(dá)強(qiáng)度高于IFR組（P<0.05）.細(xì)胞凋亡與Bcl2和HIF1α表達(dá)強(qiáng)度的變化呈正相關(guān)(r=0.872,0.945,P<0.05).結(jié)論:高原地區(qū)嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇大鼠肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)量隨海拔梯度升高而增加,Bcl2和HIF1α對(duì)細(xì)胞凋亡具有調(diào)節(jié)作用.

【關(guān)鍵詞】燒傷；復(fù)蘇術(shù)；肺泡/細(xì)胞學(xué)；上皮細(xì)胞；TUNEL；HIF1α；組織芯片；免疫組化；高原

0引言

近年的研究表明,多種臟器在發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡［1-2］,但對(duì)于高海拔地區(qū)嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇后大鼠肺組織的細(xì)胞凋亡及其基因調(diào)控機(jī)制,尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立高海拔地區(qū)大鼠嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇模型,應(yīng)用組織芯片技術(shù)［3-4］、原位末端標(biāo)記技術(shù)、免疫組織化學(xué)染色和圖象分析技術(shù),研究高海拔地區(qū)嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇大鼠肺組織細(xì)胞凋亡及其可能的調(diào)控機(jī)制.

1材料和方法

1.1材料健康雄性Wistar大鼠240只(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供),體質(zhì)量(250±30)g,致傷前1wk,置室溫19～25℃.實(shí)驗(yàn)前24h用電推推去背部被毛,單籠飼養(yǎng).實(shí)驗(yàn)前12h禁食、水.10mg/L戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉,分別在中度高原(1517m)和高原(3848m)地區(qū)建立大鼠背部30%Ⅲ度燙傷模型(病理證實(shí)),致傷條件為90℃,20s.每一海拔梯度隨機(jī)分3組:即時(shí)復(fù)蘇組(IFR,n=60),即刻腹腔注射等滲鹽水4mL/kg;延遲復(fù)蘇組(DFR,n=50),6h后腹腔注射等滲鹽水4mL/kg;正常對(duì)照組(n=10),模擬燙傷,不補(bǔ)液.原位末端標(biāo)記試劑盒:TUNEL(3%H2O2,檸檬酸緩沖液,TBS,封閉液生物素化抗體和地高辛抗體,DAB顯色劑等)由武漢博士德生物工程有限公司提供.HIF1α:兔多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司),工作濃度1∶100;Bcl2：鼠單克隆抗體(北京中杉生物工程有限公司)工作濃度1:100;SP試劑盒(北京中杉生物工程有限公司,武漢博士德生物工程有限公司);彩色病理圖文分析系統(tǒng)(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司);組織芯片制作儀(朝陽(yáng)恒泰科技發(fā)展有限責(zé)任公司).

1.2方法

1.2.1取材傷后1,6,12,24,72,168h,每組取10只動(dòng)物,將大鼠處死,迅速開胸,于肺尖部切取0.5cm×0.5cm×0.5cm大小組織,10%甲醛固定,置4℃冰箱.對(duì)照組同上述方法.

1.2.2組織芯片的制備應(yīng)用組織芯片制作技術(shù)制備42（6×7）點(diǎn)列陣的組織芯片,即由實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相點(diǎn)肺組織標(biāo)本與相應(yīng)海拔梯度對(duì)照組肺組織標(biāo)本組成.具體操作如下:①所有標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定,56～58℃熔點(diǎn)石蠟包埋,3～4μm切片,經(jīng)蘇木素伊紅染色,復(fù)核病理診斷,并在切片上標(biāo)記出典型的病變區(qū)域;②用組織芯片制作儀的針孔芯針在無(wú)組織的空白蠟塊上鉆孔(直徑1.8mm);③借助玻片上的標(biāo)記找準(zhǔn)蠟塊上的相應(yīng)部位,用組織芯針采集組織芯;④將組織芯轉(zhuǎn)移到空白蠟塊中相應(yīng)的孔中,如此反復(fù)將數(shù)百個(gè)組織芯整齊有序安插在空白的蠟塊中,就制成了組織芯片蠟塊;⑤空位Marker選用兩個(gè)正常的肝臟組織,位于芯片的一角.

1.2.3病理學(xué)觀察將不同海拔高度實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組肺組織標(biāo)本石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察照像.

1.2.4免疫組織化學(xué)分析采用SP法免疫組織化學(xué)染色,按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行,DAB顯色,蘇木素復(fù)染.對(duì)照組用PBS液代一抗.免疫組化定量分析:每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野,測(cè)每個(gè)視野陽(yáng)性信號(hào)平均灰度值.反應(yīng)免疫組化染色越深,灰度越小,即陽(yáng)性表達(dá)越高.

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料用x±s表示;組間比較采用方差分析及LSDt檢驗(yàn);雙變量相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析,α=0.05.

2結(jié)果

2.1組織芯片整體觀察42個(gè)點(diǎn)陣排列整齊,HE染色無(wú)掉片、重疊和扭曲現(xiàn)象,適合免疫組化染色的觀察和結(jié)果的判定.

2.2不同海拔高度肺組織細(xì)胞凋亡的變化與正常對(duì)照組比較IFR組與DFR組在各時(shí)相點(diǎn)表達(dá)均增強(qiáng),主要分布在肺泡上皮細(xì)胞的胞核.定量分析示(表1):①DFR組與IFR組在兩個(gè)高度各時(shí)相點(diǎn)均高于對(duì)照組(P<0.05);②同一海拔高度,DFR組在6,12,24h時(shí)相點(diǎn),其陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均高于相對(duì)應(yīng)的IFR組時(shí)相點(diǎn)(P<0.05);③高海拔DFR組與IFR組的表達(dá)強(qiáng)度,在6,12,24h時(shí)相點(diǎn),強(qiáng)于低海拔DFR組與IFR組(P<0.05).

2.3不同海拔高度肺組織Bcl2的變化與正常對(duì)照組

比較,IFR組與DFR組在各時(shí)相點(diǎn)表達(dá)均增強(qiáng),主要分布在肺泡上皮細(xì)胞的胞漿.定量分析示(表2):①DFR組與IFR組在兩個(gè)高度各時(shí)相點(diǎn)均高于對(duì)照組(P<0.05);②海拔1517mDFR組與IFR組相比,DFR組在6,12,24,72h時(shí)相點(diǎn),其Bcl2表達(dá)強(qiáng)度均高于IFR組(P<0.05);海拔3848mDFR組與IFR組相比,DFR組6h陽(yáng)性表達(dá)最明顯,IFR組于24h表達(dá)最明顯;③高海拔DFR組與IFR組的表達(dá)強(qiáng)度在6,12,24,72h時(shí)相點(diǎn),強(qiáng)于低海拔DFR組與IFR組(P<0.05).

2.4不同海拔高度肺組織HIF1α的變化正常對(duì)照組比較IFR組與DFR組在各時(shí)相點(diǎn)表達(dá)均增強(qiáng),主要分布在肺泡上皮細(xì)胞的胞核或胞漿.定量分析示(表3):①DFR組和IFR組在兩個(gè)高度各時(shí)相點(diǎn)均高于對(duì)照組(P<0.05);②同一海拔高度DFR組與IFR組相比,前者在6,12,24,72h時(shí)相點(diǎn),其HIF1α表達(dá)強(qiáng)度均高于相對(duì)應(yīng)的IFR組時(shí)相點(diǎn)(P<0.05)；③高海拔DFR組與IFR組的表達(dá)強(qiáng)度分別與低海拔DFR組與IFR組相比,在6,12,24,72h時(shí)相點(diǎn),高海拔DFR組強(qiáng)于低海拔DFR組(P<0.05).表1兩個(gè)海拔燙傷后大鼠肺臟組織TUNEL標(biāo)記細(xì)胞凋亡免疫組化灰度值的比較表2兩個(gè)海拔燙傷后大鼠肺臟組織Bcl2免疫組化灰度值的比較(表3兩個(gè)海拔燙傷后大鼠肺臟組織HIF1α免疫組化灰度值的比較

2.5相關(guān)性分析細(xì)胞凋亡與Bcl2間呈正相關(guān)(r=0.872,P<0.05)；細(xì)胞凋亡與HIF1α間呈正相關(guān)(r=0.945,P<0.05).

3討論

Bcl2是重要的抗細(xì)胞凋亡基因,在嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇后肺損傷中表現(xiàn)得尤為突出,本實(shí)驗(yàn)顯示在海拔1517m,傷后12h在DFR組肺泡上皮細(xì)胞即出現(xiàn)凋亡細(xì)胞,與此同時(shí),相應(yīng)位Bcl2呈高度表達(dá),表明肺臟組織在嚴(yán)重?zé)齻舆t復(fù)蘇后的肺泡上皮細(xì)胞可能是通過(guò)Bcl2的過(guò)度表達(dá)來(lái)發(fā)揮其抗凋亡作用,減輕細(xì)胞損傷.Bcl2抗細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與以下幾方面有關(guān):①抑制Ca2+的釋放;②bc12通過(guò)阻止促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因信號(hào)傳遞或阻止這些誘導(dǎo)基因產(chǎn)物發(fā)揮作用;③細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用.也有研究表明,Bcl2抗氧化作用是間接的,即可能在于抑制超氧陰離子的產(chǎn)生而不是直接清除活性氧,而bc12的這種抑制超氧陰離子的作用與其能抑制細(xì)胞色素C的釋放有關(guān).而在海拔3848m,傷后24hDFR組肺泡上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞大量凋亡,相應(yīng)位Bcl2的表達(dá)卻較弱,表明高海拔地區(qū)缺氧及缺血再灌注損傷更易引起肺組織細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制為:①缺氧條件下Bcl2家族表達(dá)發(fā)生變化;②高海拔地區(qū)缺氧可通過(guò)降低Bcl2基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生,這與司少艷等采用DNA降解、TUNEL法染色標(biāo)記和Bcl2mRNA點(diǎn)雜交檢測(cè)大鼠在慢性缺氧時(shí)胸腺細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果表明慢性缺氧可通過(guò)降低Bcl2基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)大鼠胸腺細(xì)胞凋亡的發(fā)生相一致［5］;③Bcl2可抑制導(dǎo)致凋亡或壞死的活性氧形成,還通過(guò)調(diào)節(jié)質(zhì)子流出而阻斷細(xì)胞凋亡;④缺氧誘導(dǎo)的凋亡主要是被抗凋亡蛋白過(guò)表達(dá)來(lái)阻滯的,并且是以劑量依賴性的方式作用.

HIF1α是一種隨細(xì)胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的快速轉(zhuǎn)錄因子.我們實(shí)驗(yàn)表明在高海拔地區(qū)嚴(yán)重?zé)齻舆t復(fù)蘇后,缺血、缺氧誘導(dǎo)了HIF1α的表達(dá)，提示HIF1α參與了不同海拔嚴(yán)重?zé)齻舆t復(fù)蘇后肺損傷的過(guò)程,促進(jìn)了肺組織細(xì)胞的凋亡.目前認(rèn)為,HIF1α表達(dá)增強(qiáng),促進(jìn)肺組織細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與低氧、缺血再灌注狀態(tài)下細(xì)胞線粒體產(chǎn)生大量的活性氧,以及與缺血再灌注后產(chǎn)生的OH有關(guān),它們能夠穩(wěn)定HIF1α,使HIF1α免于被迅速降解.低海拔正常對(duì)照組HIF1α在肺泡上皮細(xì)胞不表達(dá),是由于正常細(xì)胞在常氧環(huán)境中,HIF1α的半衰期極短,產(chǎn)生之后迅速被泛素化,繼而由蛋白酶溶解［6］.

綜上所述,不同海拔地區(qū)嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇后可以引發(fā)肺組織細(xì)胞壞死和凋亡,其細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生可能與Bcl2和HIF1α基因蛋白的過(guò)量表達(dá)有關(guān).

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