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作者：趙領(lǐng)洲，張玉梅，魏艷萍，李健學(xué)

作者：晁曉東,費(fèi)舟,張磊,李娟,仝武軍

【摘要】目的：克隆大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（eaat3）的cDNA，構(gòu)建其真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染Hella細(xì)胞.方法：從大鼠的腦組織中提取RNA,采用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增EAAT3的基因編碼區(qū)序列,將序列定向克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+).經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到Hella細(xì)胞中，通過免疫印跡法鑒定其表達(dá).結(jié)果:經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定證實(shí)EAAT3基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功.免疫印跡法證實(shí)EAAT3基因的表達(dá).結(jié)論:成功克隆了EAAT3編碼區(qū)序列,并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體,為以EAAT3為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療奠定了基礎(chǔ).

【關(guān)鍵詞】載體蛋白質(zhì)類;谷氨酸;真核表達(dá)載體

0引言

通常認(rèn)為，細(xì)胞外液中沒有使谷氨酸（Glu）失活的水解酶系統(tǒng).對(duì)從神經(jīng)末梢釋放出來的Glu的清除和失活的唯一途徑是通過位于突觸前膜和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT)的攝取而實(shí)現(xiàn)［1］.目前，已克隆了5種EAAT［2］，分別是EAAT1，EAAT2，EAAT3，EAAT4和EAAT5.EAAT3主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬結(jié)構(gòu)的CA1CA4區(qū)的錐體細(xì)胞層、齒狀回、小腦的顆粒細(xì)胞層及大腦皮質(zhì)的ⅡⅣ［3］.最近研究證明EAAT3與主要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如肌萎縮性側(cè)束硬化癥、阿爾茲海默病、帕金森病、癲癇、腦缺血、外傷性腦損傷和精神分裂癥等有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚.我們通過對(duì)大鼠EAAT3基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆及序列分析,為研究和防治由于EAAT3功能紊亂而導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料成年雄性SD大鼠1只，體質(zhì)量350g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)（Invitrogen公司）；感受態(tài)大腸桿菌TOP10，pGEMTeasy試劑盒（Promega公司）；Trizol及l(fā)ipofection2000（Invitrogen公司）；QuantscriptRTKitcDNA第一鏈合成試劑盒、TaqPlusDNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒及DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ，EcoRI及T4DNA連接酶（TaKaRa公司）；EAAT3抗體（美國(guó)Santacruz公司）；其它試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2方法

1.2.1腦組織RNA的提取用10g/L戊巴比妥鈉按20mg/kg靜脈麻醉大鼠，斷頭取全腦，-70℃保存.取-70℃凍存的腦組織100mg，加入預(yù)冷至4℃的TrizolReagent1mL裂解細(xì)胞，用2mL勻漿器勻漿，靜置10min后將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至微量離心管中，加1mL氯仿，振蕩15s，室溫靜置2～3min，4℃，12000g離心15min.取上清液移入新的微量離心管，加異丙醇2.5mL，輕輕混勻，室溫靜置5～10min，4℃，12000g離心10min.棄上清，加入750mL/L乙醇1mL，洗滌沉淀物，4℃，7500g離心5min.棄上清，將沉淀物在真空中干燥5～10min.用DEPC水15μL溶解沉淀，-70℃保存.取待測(cè)樣品2μL，紫外分光光度計(jì)比色法定量分析RNA含量.RNA實(shí)驗(yàn)過程中，所有實(shí)驗(yàn)用品均經(jīng)DEPC處理，滅活RNA酶.

1.2.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中已報(bào)道的大鼠EAAT3cDNA(X94255)的基因序列設(shè)計(jì)合成大鼠EAAT3引物,上游引物:5′GAATTCGCCACCATGGGGAAGCCCACGAGCT3′,設(shè)有EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物5′CTCGAGCTAGAACTGCGAGGTCTGAGTGAAC3′設(shè)有XhoⅠ酶切位點(diǎn).

1.2.3RTPCR擴(kuò)增大鼠EAAT3cDNA根據(jù)TIANGEN公司試劑盒說明，用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄獲得EAAT3cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增.反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃5min,94℃30s，61℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min.將PCR產(chǎn)物5μL在含溴化乙錠的10mL/L瓊脂糖凝膠電泳,用ImageMaster9.VDS電泳成像裝置觀察結(jié)果并拍照.

1.2.4目的基因克隆和酶切鑒定將PCR回收產(chǎn)物與pGEMT載體于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在鋪有IPTG及XβGal的氨芐青霉素瓊脂糖平板上進(jìn)行藍(lán)白菌落篩選,挑取白色陽(yáng)性菌落,37℃過夜培養(yǎng)菌體.取菌液,提取質(zhì)粒DNA,用EcoRI,XhoⅠ雙酶切.觀察EAAT3片段是否已克隆到pGEMT載體中.

1.2.5DNA序列測(cè)定挑選酶切鑒定正確的重組菌pGEMT/EAAT3,以重組質(zhì)粒DNA為測(cè)序模板,由上海捷瑞生物技術(shù)公司測(cè)序.并用Sequence3.0分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

1.2.6大鼠EAAT2真核表達(dá)載體的構(gòu)建將帶有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的pGEMT/EAAT3雙酶切,純化回收酶切片段,同樣對(duì)pcDNA3.1(+)載體進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切純化回收,完全酶切后將pcDNA3.1(+)載體和EAAT3片段用T4DNA連接酶連接過夜,構(gòu)建大鼠EAAT3真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/EAAT3,將連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10,用Amp抗性篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA.用EcoRI,XhoⅠ雙酶切、PCR方法鑒定所篩選的陽(yáng)性克隆.將所克隆片段的序列在NCBI/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)和分析.

1.2.7轉(zhuǎn)染hella細(xì)胞將Hella細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含100mL/L小牛血清的DMEM中，于轉(zhuǎn)染前1日收集細(xì)胞并接種于鋪有蓋玻片的六孔板中，細(xì)胞密度為6×105/孔.于37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)24h，使每孔中細(xì)胞匯合達(dá)80%左右.按PolyfectTrans

fectionReagent說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，重組質(zhì)粒各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔操作如下：將重組質(zhì)粒1μg溶于100μL不含血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，加入20μLPolyfect，旋渦混勻.20℃～25℃靜置5～10min后，加入0.6mL含血清及抗生素DMEM培養(yǎng)基.吸出六孔板孔中的培養(yǎng)液，加入1.5mL含血清及抗生素新鮮DMEM培養(yǎng)基，迅速加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物，輕輕搖勻，37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)48h后檢測(cè)目的基因的表達(dá).轉(zhuǎn)染同時(shí)另設(shè)空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照和空白對(duì)照.

1.2.8免疫印跡法鑒定瞬時(shí)表達(dá)SDSPAGE后，用半干轉(zhuǎn)移儀將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜(NC膜)上，用10mL50g/L的脫脂奶粉封閉.一抗為1∶100兔抗鼠EAAT3多克隆抗血清,二抗為1∶5000用過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG.用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光蛋白免疫印跡法進(jìn)行WesternBlot顯色分析.

2結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物的克隆及酶切鑒定

2.1.1RTPCR結(jié)果通過RTPCR得到一條大小1571bp的單一特異性條帶，與預(yù)期的EAAT3片段大小相符（圖1）.

1:DNAMarkerⅣ;2:EAAT3PCR產(chǎn)物.

圖1PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析

2.1.2pGEMT/EAAT3重組質(zhì)粒PCR及酶切鑒定對(duì)pGEMT/EAAT3經(jīng)EcoRI,XhoⅠ雙酶切后,瓊脂糖電泳后顯現(xiàn)大小約1571bp的基因片段（圖2）.

1:DNAMarkerⅣ;2:pGEMT/EAAT3雙酶切.

圖2重組pGEMT/EAAT3質(zhì)粒的EcoRI和XhoⅠ雙酶切鑒定

2.1.3pcDNA3.1(+)/EAAT3真核表達(dá)重組質(zhì)粒PCR及酶切鑒定挑選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增并提取DNA.經(jīng)EcoRI,XhoⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳后顯現(xiàn)大小約1571bp的基因片段（圖3）.陽(yáng)性克隆進(jìn)一步進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖電泳后出現(xiàn)目的基因片段，表明插入片段的存在.

1:DNAMarkerⅣ;2:pcDNA3.1EAAT3雙酶切.

圖3重組pcDNA3.1(+)/EAAT3質(zhì)粒的EcoRI和XhoⅠ雙酶切鑒定

2.2陽(yáng)性重組質(zhì)粒的提取及質(zhì)粒測(cè)序?qū)⒊鹾Y的2個(gè)陽(yáng)性重組菌通過搖菌、質(zhì)粒提取并純化,進(jìn)行DNA測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與GenBank中大鼠EAAT3基因(X94255)的標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致.

2.3WesternBlot鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/EAAT3的Hella細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白可以被抗EAAT3抗體所特異性識(shí)別，其大小與預(yù)期相同，同時(shí)空載體組與空白對(duì)照組無條帶，表明EAAT3在Hella細(xì)胞中得到表達(dá)(圖4).

3討論

Glu是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),可激活離子型受體和代謝型受體，參與神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及病理等生命過程［4］.釋放至突觸間隙的Glu主要由位于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的高親和力Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體重?cái)z取而失活［5］,因此,EAAT對(duì)保持突觸間隙內(nèi)Glu濃度在正常水平起重要作用，其主要功能是使Glu從突觸間隙和細(xì)胞外液被迅速轉(zhuǎn)運(yùn).它以跨細(xì)胞膜的Na+,K+和H+濃度梯度作為驅(qū)動(dòng)力，轉(zhuǎn)運(yùn)2個(gè)Na+和1個(gè)K+攜帶1個(gè)負(fù)電荷的Glu進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)有1個(gè)K+和可能加上1個(gè)OH-/HCO3-從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外作為交換，并至少有一個(gè)陽(yáng)離子產(chǎn)生靜電效應(yīng)，因此Glu轉(zhuǎn)運(yùn)伴隨有電流產(chǎn)生.正常生理?xiàng)l件下，EAAT將Glu攝入到神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，這種攝入依賴正常的電位差，尤其是細(xì)胞內(nèi)外的鈉離子梯度，使Glu在細(xì)胞內(nèi)外的濃度差在1×103倍以上.

然而在很多病理情況下，EAAT抑制通過抑制反向轉(zhuǎn)運(yùn)而減少Glu的釋放.帕金森病與EAAT3有很密切地相關(guān)性［6］；EAAT3表達(dá)水平在顳葉癲癇患者的病變組織中顯著升高［7］；在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究中發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與EAAT的下降明顯有關(guān),但是在全腦缺血時(shí)EAAT3表達(dá)升高［8］；次聲損傷后，EAAT明顯下降［9］.Glu的濃度和位置的改變對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的功能有著重要的意義，而它的攝取是其清除的主要途徑，盡管現(xiàn)在研究已經(jīng)表明EAAT3的功能與蛋白激酶C等密切相關(guān)［10］，但具體機(jī)制尚不清楚.因此，我們的EAAT真核表達(dá)載體的構(gòu)建為進(jìn)一步了解和治療以其為誘因而導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定了基礎(chǔ).

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