本站小編為你精心準備了濃香型白酒高通量法分析窖泥微生物參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

摘要:采用華北地區濃香型白酒企業的窖泥為實驗材料,對其理化性質及微生物菌群進行了研究。發現:隨著窖齡的增長,窖泥中的水分前五年下降較快,隨后呈緩慢下降趨勢,最終穩定在33%左右,而且窖壁泥的含水量小于窖底泥;窖泥的pH為5.0~7.0,且窖壁泥的pH小于窖底泥pH;窖泥土壤有效磷、速效鉀等物質隨著窖齡的增長也呈增加趨勢。采用高通量分析,研究窖泥樣品中微生物的群落結構,解析濃香型白酒不同窖齡窖泥中優勢微生物和特征微生物,為人工窖泥的培養、濃香型白酒質量的提高提供理論依據。

關鍵詞:濃香型白酒;理化性質;窖泥微生物;高通量測序

窖泥是濃香型酒品質的保障。研究窖泥的理化性質,改善微生物的發酵環境,為白酒的釀造提供品質保障。此外,窖泥中微生物的種類、數量、種群間的相互作用及代謝的多樣性同樣影響著白酒的品質[1]。隨著科技的發展,涌現出了許多研究窖池環境微生物的新方法。本文運用高通量測序技術,建立了一套分析窖泥細菌群落的方法,準確、完整解析了濃香型白酒的窖泥中細菌的群落結構,為窖泥中微生物菌群的研究提供了理論依據。

1材料與儀器

1.1樣品來源

窖泥樣品來源于華北地區某酒廠。

1.2試劑及儀器

1.2.1試劑細菌總DNA提取試劑盒購,自北京天根生化科技公司;TaqMasterMix,購自南京諾唯贊生物科技有限公司;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒,購自上海生工股份有限公司;DNAMarker2000,購自南京諾唯贊生物科技有限公司。1.2.2儀器離心機(TGL-16B);電泳儀(BG-Power600i);PCR儀(MG-96G);紫外凝膠成像系統(BIO-RAD);MettlerToledopH計。

2實驗方法

2.1窖泥取樣方法

分別從0、5、10、15、20、30年的窖池的壁和底部不同位置采用五點取樣法取10g酒窖用泥。

2.2理化指標檢測方法

2.2.1pH將新鮮窖泥與超純水1∶3(W/V)比例混合均勻,然后用pH計測定其pH。2.2.2含水量新鮮窖泥在105℃條件下烘干2h,根據窖泥樣品烘干前后的質量差計算樣品含水量[2-3]。2.2.3速效鉀和有效磷速效鉀檢測方法:火焰光度法[4],用mg/kg表示;有效磷檢測方法:0.5mol/LNaHCO3浸提-鉬銻抗比色法。

2.3高通量測序

2.3.1供試樣品華北地區北部某酒廠窖齡分別為5年和15年的窖中泥、窖壁泥和窖底泥,每個樣品取樣采用五點混合并混勻的方式,樣品置于4℃的冰箱中儲存。6個樣品及其編號見表1。2.3.2土壤細菌總DNA提取分別取等量(0.3g)窖泥樣品,使用土壤基因組DNA提取試劑盒提取總DNA,每個樣品提取3個,保證實驗結果的可靠性。總DNA于-20℃下冷凍保存備用。2.3.3樣品16SrDNAV3可變區的擴增和高通量測序選用細菌16SrDNA通用引物,對樣品進行PCR擴增。反應體系:TaqMasterMix10μL、模版1μL、正反引物各0.5μL,用DDH2O(雙蒸水)補足20μL。反應條件:94℃變性10min;94℃40s、58℃30s、72℃30s,30次循環;72℃延伸10min。擴增產物純化回收,基因測序由中科院成都生物研究所通過上海派森諾生物科技股份有限公司進行高通量測序完成。

3結果與討論

3.1窖泥pH的變化

pH是影響環境微生物生理代謝活動的重要指標,與功能菌的生長有密切關系。隨著窖泥窖齡的增長,其pH會出現不同程度的變化。pH太高或者太低都會影響微生物新陳代謝,因此維持適合產香功能菌生長的窖泥pH的穩定顯得尤為重要。按窖泥取樣方法,分別從窖池的壁和底部取樣,按2.2.1方法測定窖泥的pH,結果見圖1。由圖1可知,窖壁泥的pH會隨著窖齡的增長呈現下降的趨勢,由最初的pH7的中性窖泥慢慢變成酸性,最終會維持在pH5左右;而窖底泥的pH則會由中性變為偏堿性,從最初的pH7變為pH7.5。窖壁泥和窖底泥的pH變化有差異:窖壁泥pH在下降,這是因為窖壁泥透氣性較好,含氧量相對較高,由于某些不當操作,導致常年使用的窖壁泥滋生大量的乳酸菌,產生過多的乳酸,導致pH下降;而窖底泥pH較為穩定,且隨著時間的積累表現為中性偏弱堿性。該研究結果與張宿義等[5]、景曉衛等[6]報道的基本一致。土壤細菌數量與pH呈顯著正相關,中性pH和較高水平的生物多樣性有利于生態功能的正常發揮。因此,窖底泥偏中性pH的環境可能更有利于白酒發酵生產,這在一定程度上可解釋為何下層酒糟所產白酒酒質往往優于上層酒糟。

3.2窖泥含水量的比較

水在白酒釀造過程中具有舉足輕重的作用,對窖泥來說尤為重要。窖泥含水量過高會導致窖泥掛壁難甚至垮窖,水分缺失又會導致窖泥板結、鹽類析出、窖泥中部分微生物死亡,最終導致窖泥老化[7-9],嚴重影響生產。按窖泥取樣方法,分別從不同窖齡的窖池的壁和底部取樣,按2.2.2方法測定窖泥的含水量,結果由圖2可知,五年窖齡的窖壁泥和窖底泥含水量下降較快,而隨著窖齡的增長,含水量呈緩慢下降趨勢,最終窖泥的最佳含水量為33%左右。窖壁泥的含水量略低于窖底泥,推測其原因,可能是在生產過程中物料反復出入窖池,導致窖壁泥水分蒸發。此外,窖泥含水量雖是一個重要指標,但其檢測結果受較多因素影響,如:不同地區、不同酒廠生產工藝差別較大,黃水的不同提取方式以及提取時間、黃水坑在窖池中的分布位置和窖泥取樣的時間等,都會對窖泥含水量測定結果造成影響。

3.3窖泥土壤中的有效磷和速效鉀的含量變化

窖泥的品質與多種無機鹽有關。磷、鉀是微生物生長繁殖以及生理代謝不可缺少的微量元素,其含量過高或過低對酒質均有影響。窖泥中的有效磷不僅是窖泥微生物繁殖的必需物質,又是合成蛋白質的重要物質[10]。磷是參與乙醇、乙酸合成己酸的重要物質,所以窖泥中速效磷含量不僅影響己酸菌的數量,而且影響濃香型酒主體香味物質己酸乙酯的產率。窖泥中的有效鉀主要是指水溶性鉀,是微生物必需的無機鹽[11-12]。按窖泥取樣方法,分別從不同窖齡的窖池的壁和底部取樣,按2.2.3方法測定窖泥中有效磷和速效鉀含量,結果見圖3。圖3窖泥中的有效磷、速效鉀含量變化圖由圖3可知:隨窖齡的增長,窖泥中的有效磷和速效鉀含量都會上升,而且窖壁泥中的速效鉀在15~30年升高較快;同一窖齡窖池的窖底泥中速效鉀含量高于窖壁泥,這是因為生產過程中酒醅、酒曲和水的循環使用使得窖泥中有效磷和速效鉀含量累積增加。隨著窖齡的增加,窖泥組成和微生物菌系不斷變化,窖泥生態環境逐漸適合微生物的生長繁殖,窖泥微生物逐步增多,窖泥和微生物互相影響、互相促進,使窖泥中有效磷和速效鉀含量不斷上升,進一步提高了窖泥質量。

3.4窖泥微生物種群群落組成分析

目前,對不同窖齡窖泥中活性微生物演替規律研究較多[13],對不同性狀窖泥微生物群落結構差異研究較少。高通量測序技術以其成本低、通量高、信息豐富等特點普遍應用于窖泥微生物群落結構研究[14]。對5年和15年窖齡的窖壁、窖中和窖底泥,按窖泥取樣方法取樣,通過高通量測序,從門水平和屬水平分析群落組成及豐度,結果如圖4、圖5所示。72高通量測序結果顯示:窖泥相關細菌歸屬于19個門。對門水平上相對豐度前20位的細菌分析,結果如圖5所示。兩種年限窖泥中優勢菌門主要有兩個:Firmicutes(硬壁菌門)和Proteobacteria(變形菌門)。其中Firmicutes為絕對優勢菌門(71.8%~97.6%),樣品JSJB2中Proteobacteria比例最高(2.9%)。在屬水平,豐度排名前二十的細菌分布如圖6所示。年限不同的窖池中,主要菌屬是有所不同的。在5年窖池中優勢菌屬有:Lysinibacillus(桿菌屬)占59.6%~71.3%,Clostridium_sensu_stricto_1(梭菌屬)占12.7%~14.9%,Clostridium_sensu_stricto_13占4.3%~5.5%。且各菌屬在不同部位比例相差不大。在15年窖池中優勢菌屬有:Clostridium_sensu_stricto_12占20.6%~56.5%,Virgibacillus(硫胺素芽孢桿菌屬)占21.9%~38.2%,Clostridium_sensu_stricto_1占1.9%~9.2%。其中Clostridium_sensu_stricto_12在窖底泥中的比例最高,Clostridium_sensu_stricto_1在窖底泥中比例最低。可見,15年窖池窖底泥中菌屬比例較另外兩種樣品差異比較大。

4結論與展望

通過對華北地區濃香型白酒企業窖泥的理化性質和微生物種群進行研究,發現隨著窖齡的增長,窖壁泥中的含水量和pH均有不同程度的下降,而有效磷和速效鉀的含量均有不同程度的上升。采用高通量測序,從門水平和屬水平解析了5和15年窖齡窖泥的微生物種群,發現同一窖齡的不同位置的窖泥中微生物的差異性不大,但隨著窖齡的增長,窖泥中的微生物的豐富度有明顯提高。濃香型白酒的品質與窖泥息息相關。由于窖泥中微生物的復雜性,需要利用現代分子生物學手段對生產過程中的不同窖池窖泥中功能微生物的多樣性進行詳細研究,以期更好地指導白酒生產,提高濃香型白酒的品質。

參考文獻:

[1]沈怡方.白酒生產技術全書[M].北京:中國輕工業出版社,2013:8-10.

[4]王金晶.常規火焰光度法測定復混肥中氧化鉀的方法改進[J].磷肥與復肥,2011,26(3):64-66.

[5]張宿義,許德富.瀘型酒技藝大全[M].北京:中國輕工業出版社,2011.

[6]景曉衛,唐玉明,任道群,等.人工老窖發展及其研究現狀[J].釀酒科技,2010(9):77-80.

[7]邢德峰,任南琪,宋業穎,等.PCR-DGGE分析產氫發酵系統微生物群落動態及其種群多樣性[J].生態學報,2005,25(7):296-301.

[8]蘇慧玉,鐘雨,沈勇.窖泥中的水分、腐殖酸對窖泥質量的影響[J].釀酒,1996(5):11.

[9]謝軍,朱莉莉,鄧波,等.濃香型白酒窖泥水分含量與水分活度的對比研究[M].中國釀造,2018,37(1):79-82.

[10]卜宇宏.濃香型有機窖泥的研究[J].釀酒,2011(4):35-38.[11]江源.《瀘型酒技藝大全》通過科研立項[J].釀酒科技,2010(8):39.

[12]楊劍虹,王成林,代亨林.土壤農化分析與環境監測[M].北京:中國地質大學出版社,2008.

[13]王明躍,張文學,王海英,等.不同窖齡窖泥細菌的系統發育多樣性分析[J].食品科學,2013,34(11):177-181.

[14]樓駿,柳勇,李延.高通量測序技術在土壤微生物多樣性研究中的研究進展[J].中國農學通報,2014,30(15):256-260.

作者：李俊輝 張志偉 劉英杰 楊平平 王燕 單位：齊魯工業大學