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《生物技術(shù)雜志》2014年第二期

1方法

1.1菌株富集培養(yǎng)取100mL松花江水放入無(wú)菌的500mL三角瓶中，8℃、160r/min震蕩培養(yǎng)3～5d直至培養(yǎng)液渾濁，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2氨氮降解菌篩選取1mL富集培養(yǎng)液加入含100mL異氧硝化細(xì)菌培養(yǎng)基的三角瓶中，8℃、160r/min震蕩培養(yǎng)2d，倍比稀釋后，取103稀釋液100mL涂布在異氧硝化細(xì)菌固體平板上，8℃低溫培養(yǎng)2～4d，挑取單菌落劃線純化。采用納氏試劑平板法初篩脫氨氮菌株，取純化后的菌株點(diǎn)接在異氧硝化細(xì)菌固體平板上，8℃低溫培養(yǎng)2d，去掉菌落，加入5mL納氏試劑，測(cè)量菌落周圍的透明圈直徑。

1.3菌株鑒定形態(tài)鑒定:將培養(yǎng)24h的菌液，革蘭氏染色后顯微鏡下觀察形狀大小。生理生化特性鑒定:按照參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行接觸酶、氧化酶、精氨酸雙水解酶、V.P試驗(yàn)、M.R試驗(yàn)、葡萄糖利用、明膠液化試驗(yàn)。16SrDNA序列分析:用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，離心收集菌體，用北京康為世紀(jì)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，用細(xì)菌通用引物Primer1:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和Primer2:TACGGYTACCTTGT-TACGACTT進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測(cè)序，在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行DNA序列分析，用MEGAversion4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。BIOFOSUN微生物鑒定分析系統(tǒng)鑒定:按照BIOFOSUN微生物鑒定分析系統(tǒng)說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.4菌株低溫氨氮降解能力測(cè)定用500mL基本培養(yǎng)液培養(yǎng)氨氮降解菌，離心收集菌體，用無(wú)菌水洗滌2次，懸浮于5mL無(wú)菌水中，作為種子液。取1mL種子液接種到50mL新的異氧硝化細(xì)菌培養(yǎng)液中，3個(gè)平行樣，培養(yǎng)液初始氨氮濃度為5mg/L，碳氮比分別為10:1，pH7.0。將培養(yǎng)液在8℃、160r/min震蕩培養(yǎng)2d，每隔4h取樣測(cè)定菌濁度OD600值、氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮濃度，計(jì)算氨氮降解率。

1.5菌株的反硝化能力取1mL種子液接種到50mL新的反硝化細(xì)菌培養(yǎng)液中，3個(gè)平行樣，培養(yǎng)液初始氨氮濃度為5mg/L，碳氮比分別為10:1，pH7.0。將培養(yǎng)液在8℃、160r/min震蕩培養(yǎng)1d，每個(gè)4h取樣測(cè)定菌濁度OD600值、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮濃度，計(jì)算硝態(tài)氮降解率。

1.6分析方法采用納氏試劑光度法測(cè)定氨氮濃度，酚二磺酸光度法測(cè)定硝酸亞濃度，N－奈基－乙二胺光度法測(cè)定亞硝態(tài)氮濃度。取菌液樣品5mL，6000r/min離心5min，取1mL上清液測(cè)定，按公式氮降解率=C0－C1/C0×100%計(jì)算氮降解率，C0為初始氮濃度，C1為殘留氮濃度。

2結(jié)果與分析

2.1氨氮降解菌篩選與鑒定松花江水經(jīng)富集和分離，采用納氏試劑平板法篩選，獲得8株氨氮降解菌(圖1)，菌株WSW－1001半透明圈直徑最大為15mm。該菌株菌落白色、圓形、光滑，邊緣整齊，菌體短桿狀，大小0.2～0.4μm×1.0～1.3μm。革蘭氏陰性，好氧，氧化酶陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，精氨酸雙水解酶陽(yáng)性，利用葡萄糖和蔗糖，V.P陰性，M.R陰性，液化明膠。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小1400bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Pseudomonas.fluorescensp1－1同源性為99%(圖3)。BIOFOSUN微生物鑒定分析系統(tǒng)分析結(jié)果表明該菌株與熒光假單胞桿菌聚為1組(圖2)。結(jié)合菌株WSW－1001的形態(tài)學(xué)和生理生化特性，以及16SrDNA序列分析和BIOFOSUN微生物鑒定系統(tǒng)分析結(jié)果，菌株WSW－1001被鑒定為熒光假單胞桿菌Pseudomonasfluorescens。

2.2菌株低溫氨氮降解能力菌株WSW－1001低溫氨氮降解效果見(jiàn)圖4。菌株在8℃條件下具有較強(qiáng)的脫氮能力，48h內(nèi)，隨著菌體的生長(zhǎng)，氨氮濃度持續(xù)下降，24h對(duì)初始氨氮濃度為5.23mg/L的氨氮降解率為71.7%，48h的降解率為80.4%，脫氮過(guò)程中無(wú)亞硝態(tài)氮積累，有少量(約0.48mg/L)硝態(tài)氮產(chǎn)生。

2.3菌株的異氧反硝化能力菌株WSW－1001在以硝酸鉀為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)與硝態(tài)氮含量變化情況見(jiàn)圖5。菌株在8℃條件下能夠利用硝態(tài)氮生長(zhǎng)，24h對(duì)初始5.03mg/L硝態(tài)氮的降解率為3討論納氏試劑光度法是測(cè)定氨氮常用方法，納氏試劑與氨氮反應(yīng)生成黃棕色絡(luò)合物，顏色深淺與氨氮濃度成正比。固體平板中的氨氮被微生物降解后不能與納氏試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，因此可以通過(guò)菌落周圍半透明圈大小定性測(cè)定固體平板上生長(zhǎng)的菌株氨氮降解能力。本研究采用納氏試劑平板法可以對(duì)氨氮降解菌進(jìn)行快速初篩。細(xì)菌的鑒定方法包括傳統(tǒng)方法、分子生物學(xué)鑒定和儀器自動(dòng)化鑒定，每種方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，三種方法結(jié)合可以確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)外對(duì)于異氧硝化細(xì)菌的研究報(bào)道較多，多數(shù)菌株在常溫下脫氮效率較高，辛玉峰等報(bào)道不動(dòng)桿菌YF14在30℃培養(yǎng)3d，可去除92%的氨氮，邱曉帆等報(bào)道1株假單肥菌WSH1001在20～35℃培養(yǎng)9h，氨氮去除率達(dá)95%。對(duì)于低溫菌的研究報(bào)道較少，本文報(bào)道的菌株WSW－1001低溫氨氮降解能力高于已有報(bào)道。ZhangD等人報(bào)道從松花江水中分離出1株異氧硝化細(xì)菌MicrobacteriumspSFA13，5℃培養(yǎng)30h后對(duì)5.09mg/L初始氨氮的降解率為63.6%;ZhangJ等人報(bào)道PseudomonasstutzeriYZN－00110℃培養(yǎng)2d氨氮降解率為45.5%。本文報(bào)道的菌株WSW－1001低溫氨氮降解能力高于已有報(bào)道。

異氧硝化細(xì)菌的脫氮途徑因菌株而異。菌株WSW－1001在氨氮降解過(guò)程中檢測(cè)到少量硝態(tài)氮和微量亞硝態(tài)氮，說(shuō)明該菌株能夠通過(guò)硝化作用去除氨氮。該菌株能夠利用硝酸鹽生長(zhǎng)，而且能夠檢測(cè)到微量亞硝酸鹽生成，說(shuō)明菌株具有反硝化功能，由于沒(méi)有對(duì)菌株代謝過(guò)程中與硝化和反硝化作用相關(guān)的生化酶進(jìn)行檢測(cè)，也沒(méi)有對(duì)氨氮降解后的最終產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，因此不能明確該菌株的脫氮途徑。菌株WSW－1001的脫氮效率與菌株的生長(zhǎng)速度有關(guān)，生長(zhǎng)速度越快，氨氮降解率越高。菌株生長(zhǎng)初期，氨氮降解效率較低，降解的氨氮主要用于菌株生長(zhǎng)，隨著菌株生長(zhǎng)，產(chǎn)生一系列生化反應(yīng)，對(duì)氨氮進(jìn)行生物降解。

作者：張淑梅姜威李晶孟利強(qiáng)曹旭陳靜宇趙曉宇張?jiān)坪挝唬汉邶埥】茖W(xué)院微生物研究所黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院