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1方法

該皮膚模型的所有生物性成分及其培養(yǎng)環(huán)境均經(jīng)過(guò)病毒、細(xì)菌和支原體的測(cè)試。皮膚模型最終產(chǎn)品都要經(jīng)過(guò)MTT＆SDS細(xì)胞毒素測(cè)試和生物組織檢查。基于質(zhì)量控制的指標(biāo)，“EpiSkin”表皮模型的IC50值均大于或等于1mg/ml，可用于正式皮膚刺激性測(cè)試。用HematoxylinEosinSaffron染色來(lái)評(píng)價(jià)表皮模型是否良好分化。該皮膚模型評(píng)分均高于或等于18.0，表明表皮模型的表皮分化良好，具備基底層、網(wǎng)狀層、顆粒層和較厚的角質(zhì)層，允許用于刺激性測(cè)試。

對(duì)于每一種化學(xué)品，需要3輪不同批次的皮膚模型來(lái)對(duì)其進(jìn)行皮膚刺激性的測(cè)試。參照OECD439歐盟標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法，具體步驟如下:(1)化學(xué)品10μl(固體10mg研成粉末，同時(shí)加蒸餾水5μl)局部接觸面積約0.38cm2的皮膚模型表面15min。(2)陰性對(duì)照加10μlPBS、陽(yáng)性對(duì)照加10μl5%SDS。(3)與化學(xué)品接觸15min后用25mlPBS沖洗活性皮膚，浸入2.0ml維持培養(yǎng)基內(nèi)。1～3步需在通風(fēng)安全柜中進(jìn)行。(4)繼續(xù)在飽和濕度、5%CO2、37℃的條件下孵育42h。(5)浸入2.0ml濃度0.3mg/ml的MTT溶液(用測(cè)試培養(yǎng)基配制)內(nèi)，在飽和濕度、5%CO2、37℃孵育3h。(6)MTT反應(yīng)完的皮膚模型，浸入500μl酸化異丙醇的錐形底離心管內(nèi)，用振蕩混合儀混勻，在室溫、避光的條件下過(guò)夜。(7)振蕩混合儀混勻每個(gè)離心管，每管中取200μl標(biāo)本加入96孔板微量比色池中，在570nm用酶標(biāo)儀讀取A值，以酸化異丙醇溶液作為空白對(duì)照。將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照下列公式，將所得A值換算為細(xì)胞相對(duì)活力值，用細(xì)胞相對(duì)活力值來(lái)判斷化學(xué)品是否具有刺激性，陰性對(duì)照的平均A值相當(dāng)于100%的細(xì)胞活力(計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力值方法參照OECD439)。相對(duì)細(xì)胞活力百分比(%)=100×(某化學(xué)物的A值/陰性對(duì)照的平均A值)。求取3輪測(cè)試的相對(duì)細(xì)胞活力值的平均值，得到該化學(xué)品的細(xì)胞相對(duì)活力值。評(píng)判化學(xué)品刺激性的標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞相對(duì)活力＜50%判斷為有刺激性(I)，≥50%為無(wú)刺激性(NI)。

2結(jié)果

20種化學(xué)品的相對(duì)細(xì)胞活力百分比見(jiàn)表1。根據(jù)本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)所測(cè)試的20種化學(xué)品與歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM)的化學(xué)品分類標(biāo)準(zhǔn)(這20種化學(xué)品分類標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)兔皮膚實(shí)驗(yàn)體內(nèi)測(cè)試)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)也與歐盟認(rèn)可皮膚模型EpiSkin在歐洲的體外測(cè)試結(jié)果比較，結(jié)果見(jiàn)表2。在20種化學(xué)品中，ECVAM體內(nèi)測(cè)試分類數(shù)據(jù)表明刺激性化學(xué)品為10種，本實(shí)驗(yàn)皮膚模型能正確分類9種;非刺激性化學(xué)品為10種，能正確分類7種。將本研究的結(jié)果數(shù)據(jù)與ECVAM體內(nèi)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比較，“EpiSkin”皮膚模型的靈敏度為90%，特異性為70%，刺激性結(jié)果預(yù)測(cè)率90%，非刺激性結(jié)果預(yù)測(cè)率70%;準(zhǔn)確率達(dá)到80%。其靈敏度與特異性均達(dá)到歐盟經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織OECD認(rèn)可的要求，即靈敏性70%，特異性90%。此皮膚模型有望作為評(píng)價(jià)化學(xué)品皮膚刺激性的替代方法。

3討論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在研究疾病、開(kāi)發(fā)檢測(cè)醫(yī)藥和疫苗、評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的危險(xiǎn)性等諸多方面，有著不可或缺的重要作用。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也有實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、耗時(shí)費(fèi)力、動(dòng)物間存在個(gè)體差異等缺點(diǎn)。隨著各國(guó)有關(guān)動(dòng)物福利法律的完善，尋找替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的科學(xué)方法得到了各國(guó)政府和科學(xué)工作者的關(guān)注。許多發(fā)達(dá)國(guó)家廣泛開(kāi)展了體外替代方法的研究和驗(yàn)證工作，已涉及到皮膚刺激和腐蝕性實(shí)驗(yàn)、眼刺激和腐蝕性實(shí)驗(yàn)、光毒性實(shí)驗(yàn)、皮膚致敏性實(shí)驗(yàn)以及熱原檢驗(yàn)等。EpiDerm(MatTekCorpor-ation，Ashland，MA，USA)和EpiSkin(EPISKINSNC，Lyon，F(xiàn)rance)已被正式授權(quán)在歐盟范圍內(nèi)成為皮膚腐蝕性與刺激性檢測(cè)的工具。

本研究采用3D人工皮膚模型“EpiSkin”采用MTT方法定量細(xì)胞活力，以相對(duì)細(xì)胞活力值為標(biāo)準(zhǔn)，與ECVAM體內(nèi)測(cè)試分類結(jié)果相比較，能正確判定所選10種刺激性化學(xué)品中的9種，靈敏度達(dá)到90%;能正確判定10種非刺激性化合物中的7種，該皮膚模型特異性為70%。和被歐盟認(rèn)可的EpiSkin皮膚模型在歐洲的評(píng)價(jià)結(jié)果相一致。因此，本實(shí)驗(yàn)的測(cè)試方法的預(yù)測(cè)能力完全符合OECD439的要求。根據(jù)本研究結(jié)果得出3D人工皮膚模型“EpiSkin”可以評(píng)估化學(xué)品的皮膚刺激性。

作者：馬丹趙曉娟付溥博張西萌魏海燕劉莉曾靜單位：北京出入境檢驗(yàn)檢疫局