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摘要目的摘要：探索口腔扁平苔蘚（OLP）中Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表達(dá)意義及其和細(xì)胞凋亡的關(guān)系.方法摘要：采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）、SP免疫組化方法檢測33例OLP及7例正常口腔黏膜（對照組）中Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況.結(jié)果摘要：OLP中上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）明顯高于正常對照組(P%26lt;0.05)，而固有層的AI明顯低于正常對照組(P%26lt;0.05).OLP的上皮層和固有層Caspase3陽性表達(dá)明顯高于正常對照組(P%26lt;0.025).OLP中上皮層TNFRI及固有層TNFα陽性表達(dá)明顯高于正常對照組(P%26lt;0.025)，而上皮層TNFα及固有層TNFRI陽性表達(dá)則明顯低于正常對照組(P%26lt;0.025)，糜爛型組固有層中TNFα陽性表達(dá)明顯高于非糜爛型組(P%26lt;0.05).OLP上皮層Caspase3陽性表達(dá)和其自身AI呈正相關(guān)（r=0.631,P%26lt;0.05）,而固有層淋巴細(xì)胞Caspase3陽性表達(dá)和自身的AI無相關(guān)性(P%26gt;0.05)；TNFα/TNFRI表達(dá)和OLP上皮及固有層細(xì)胞的AI密切相關(guān).結(jié)論摘要：OLP中同時(shí)存在角質(zhì)細(xì)胞凋亡亢進(jìn)及固有層淋巴細(xì)胞凋亡的減少，這種凋亡的異常可能和OLP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).

【扁平苔癬，口腔；Caspase3；腫瘤壞死因子；TNFRΙ；細(xì)胞凋亡

0引言

口腔扁平苔蘚（orallichenplanus,OLP）是臨床上常見的口腔黏膜非感染性疾病，在臨床上主要表現(xiàn)為口腔黏膜的白色斑塊或條紋，其病理特征為上皮下固有層淋巴細(xì)胞帶狀浸潤及基底層細(xì)胞液化變性.OLP的發(fā)病機(jī)制尚無定論.近期探究表明，OLP為細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，且和細(xì)胞凋亡異常相關(guān)［1］.我們通過原位檢測OLP中Caspase3,TNFα和TNFRΙ蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況，探索Caspase3,TNFα和TNFRΙ在OLP發(fā)生發(fā)展中的功能及其和細(xì)胞凋亡的關(guān)系.

1對象和方法

1.1對象收集廣州暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院及廣東省口腔醫(yī)院2001/2004年間口腔門診OLP患者活檢標(biāo)本33（男7，女26）例，均是2mo內(nèi)未經(jīng)激光、激素、免疫調(diào)節(jié)治療的原發(fā)病例.患者年齡22～71（平均45）歲.16例取自舌部黏膜，14例取自頰黏膜，3例取自下唇黏膜.非糜爛型24例，糜爛型9例.另取7例因口腔外傷或整形手術(shù)切除的正常黏膜作為對照組.根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合HE染色，按WHO的OLP病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，由兩位臨床病理醫(yī)師分別獨(dú)立診斷，以兩人一致的結(jié)果為最終判定.根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合病理診斷，將33例OLP分為2組摘要：糜爛型9例，非糜爛型24例.試劑摘要：小鼠抗人Caspase3mAb（濃縮型）購自NeoMarkers公司，工作濃度是1∶50.小鼠抗人TNFα和TNFRImAb（濃縮型）購自SantaCruz公司，工作濃度分別是1∶400及1∶100.TUNEL試劑盒為基因公司產(chǎn)品.SP試劑盒、DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司.

1.2方法患者活檢標(biāo)本4μm厚連續(xù)石蠟切片，65℃烘烤，脫蠟、水化后微波修復(fù)抗原，免疫組化SP法檢測目標(biāo)抗原,從33例OLP中隨機(jī)選取15例（將33例隨機(jī)編號，取偶數(shù)，末例舍去），TUNEL法原位檢測15例OLP和全部正常黏膜的凋亡細(xì)胞.SP法操作步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，PBS代替一抗作為替代對照，用已知陽性片做陽性對照.TUNEL法操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，PBS替代TUNEL反應(yīng)液作替代對照.

1.2.1免疫組織化學(xué)染色Caspase3陽性染色為細(xì)胞質(zhì)或（和）細(xì)胞核內(nèi)棕黃色顆粒著色，TNFα和TNFRΙ陽性染色均為細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒著色.隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞所占的百分比.根據(jù)陽性細(xì)胞的比例記分摘要：陽性細(xì)胞比例為0，記為0分；1%～25%，記為1分；26%～50%，記為2分；%26gt;50%，記為3分.

1.2.2凋亡細(xì)胞的原位檢測細(xì)胞核呈棕褐色或細(xì)胞質(zhì)因核DNA逸出至陽性染色者，為凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)百分率,即為凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理摘要：全部數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表達(dá)結(jié)果采用非參數(shù)等級資料秩和檢驗(yàn)MannWhitneyTest，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.025（因涉及2次重復(fù)比較新問題，故調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)，α=α/2,α取0.05）.TUNEL法實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn).AI和Caspase3,TNFα和TNFRΙ表達(dá)的相關(guān)性及TNFα和TNFRΙ之間表達(dá)的相關(guān)性，采用Spearman等級相關(guān)分析.

2結(jié)果

2.1細(xì)胞凋亡情況在口腔黏膜上皮層及固有層均可見凋亡細(xì)胞，核呈棕褐色，輪廓清楚、致密.經(jīng)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)（經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),各組間總體方差齊同），OLP中上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于正常對照組（P%26lt;0.05），凋亡細(xì)胞多位于基底層或基底上層，而正常對照組中的凋亡細(xì)胞多位于表層及棘層.口腔扁平苔蘚中固有層的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于正常對照組（P%26lt;0.05），凋亡細(xì)胞多位于固有層深層（圖1A，表1）.

表1口腔扁平苔蘚和正常對照組中細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較（略）

aP%26lt;0.05vs正常黏膜組.

2.2Caspase3表達(dá)情況OLP中Caspase3的陽性率上皮層和固有層均為100%，上皮層主要表達(dá)于基底細(xì)胞和棘細(xì)胞的胞質(zhì)，亦可見胞核著色，基底細(xì)胞層及近基底細(xì)胞層陽性細(xì)胞為中度陽性表達(dá)，棘細(xì)胞層陽性細(xì)胞為弱陽性表達(dá)(圖1B);固有層近基底膜的淋巴細(xì)胞和部分炎性細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均呈強(qiáng)陽性或中度表達(dá).正常組上皮層陽性率為100%，均為弱表達(dá)；固有層陽性率為28.6%(2/7)，為個(gè)別細(xì)胞弱陽性表達(dá).和正常組相比，OLP患者上皮層角化細(xì)胞和固有層淋巴細(xì)胞表達(dá)Caspase3明顯增強(qiáng)（P%26lt;0.025，表2）.

表2口腔扁平苔蘚和正常對照組中Caspase3的表達(dá)水平（略）

aP%26lt;0.025vs正常黏膜組.上皮層，固有層分別指上皮層角化細(xì)胞和固有層淋巴細(xì)胞.

2.3TNFα和TNFRΙ表達(dá)情況OLP的TNFα陽性表達(dá)率是75.8%（25/33），其中上皮層和固有層都有表達(dá)者14例，僅上皮層表達(dá)者3例，僅固有層表達(dá)者8例，但上皮層和固有層的陽性表達(dá)率各有不同.OLP組TNFα的上皮層陽性表達(dá)率51.5%（17/33）明顯低于正常對照組的陽性表達(dá)率100%（7/7）（P%26lt;0.025），而OLP組的TNFα固有層的陽性表達(dá)率66.7%（22/33）明顯高于正常對照組的陽性表達(dá)率0.0%（0/7）（P%26lt;0.025），糜爛型組固有層中TNFα表達(dá)明顯高于非糜爛型組（P%26lt;0.05,表3）.TNFα陽性染色主要彌漫分布于胞質(zhì)，陽性細(xì)胞呈彌散性分布.上皮層陽性細(xì)胞主要分布于基底層及棘層（圖1C）.固有層中主要是圍繞上皮釘突浸潤的淋巴細(xì)胞呈陽性表達(dá)，大多數(shù)正常對照組上皮層細(xì)胞中TNFα強(qiáng)陽性表達(dá)，而固有層細(xì)胞中無表達(dá).

OLP中TNFRI的陽性表達(dá)率是48.5%（16/33），其中上皮層和固有層都有表達(dá)者為9例，僅上皮層有表達(dá)者6例，僅固有層有表達(dá)者1例，但上皮層和固有層的陽性表達(dá)率各有不同.OLP組的TNFRI的上皮層陽性表達(dá)率45.5%（15/33）明顯高于正常對照組的0.0%（0/7）（P%26lt;0.025），而固有層陽性表達(dá)率30.3%（10/33）明顯低于正常對照組的85.7%（6/7）（P%26lt;0.025,表3）.TNFRI陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞局限于上皮基底層，呈帶狀分布；固有層的淋巴細(xì)胞呈陽性，散在分布（圖1D）.

表3口腔扁平苔蘚和正常對照組中的TNFα和TNFRΙ的表達(dá)水平（略）

aP%26lt;0.025vs正常黏膜組,bP%26lt;0.05vs非糜爛型組.

2.4OLP中Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的關(guān)系OLP上皮細(xì)胞Caspase3陽性表達(dá)強(qiáng)弱和上皮細(xì)胞的AI呈正相關(guān)（r=0.631,P%26lt;0.05），固有層淋巴細(xì)胞Caspase3的陽性表達(dá)強(qiáng)弱和其自身的AI無相關(guān)性（P%26gt;0.05）.TNFα/TNFRI和OLP上皮層及固有層細(xì)胞的AI有相關(guān)性，SpearmanA摘要：口腔扁平苔蘚中固有層淋巴細(xì)胞中可見胞核被染成棕黃色的凋亡細(xì)胞TUNEL×400；B摘要：口腔扁平苔蘚上皮層基底細(xì)胞Caspase3表達(dá)陽性SP×400；C摘要：口腔扁平苔蘚上皮細(xì)胞胞質(zhì)TNFα陽性表達(dá)SP×400；D摘要：口腔扁平苔蘚固有層淋巴細(xì)胞胞質(zhì)TNFRI陽性表達(dá)SP×400.

圖1口腔扁平苔蘚中TUNEL法陽性染色及Caspase3,TNFα和TNFRI蛋白的陽性表達(dá)（略）

等級相關(guān)分析顯示OLP固有層淋巴細(xì)胞TNFα陽性表達(dá)和上皮細(xì)胞的AI呈正相關(guān)（r=0.971,P%26lt;0.05），和其自身的凋亡則呈負(fù)相關(guān)（r=-0.533,P%26lt;0.05）.OLP上皮細(xì)胞TNFRI陽性表達(dá)和上皮細(xì)胞的AI呈正相關(guān)（r=0.583,P%26lt;0.05）；固有層淋巴細(xì)胞TNFRI陽性表達(dá)和其自身的AI呈正相關(guān)（r=0.699,P%26lt;0.05）.

3討論

OLP為細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，病變的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞凋亡異常相關(guān)［1］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OLP上皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)比正常對照組高，和Hirota等［2］報(bào)道的結(jié)果一致.凋亡的上皮細(xì)胞多分布于萎縮型的OLP，這可能是因?yàn)榇罅可掀ぜ?xì)胞的凋亡導(dǎo)致了上皮層的萎縮、變薄，提示OLP上皮萎縮的改變可能和凋亡相關(guān)；同時(shí)觀察到在凋亡的上皮細(xì)胞較密集的OLP病例，多出現(xiàn)較明顯的基底細(xì)胞液化變性，故推測OLP基底層上皮細(xì)胞的液化變性和凋亡有關(guān).而觀察到OLP固有層淋巴細(xì)胞的凋亡指數(shù)比正常對照組有所降低則提示OLP固有層中淋巴細(xì)胞的凋亡受到抑制，細(xì)胞不能經(jīng)歷正常的凋亡過程而聚集在OLP的固有層中.

Caspase家族是細(xì)胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵酶類，Caspase3是最重要的效應(yīng)型Caspase.本探究結(jié)果表明，OLP患者口腔黏膜上皮表達(dá)Caspase3明顯增強(qiáng)（P%26lt;0.05），提示OLP中Caspase家族的級聯(lián)反應(yīng)是在OLP上皮層的生發(fā)層內(nèi)被激活的，胞核陽性表達(dá)是由于在細(xì)胞成熟、衰老、死亡時(shí)，Caspase3從胞質(zhì)易位到胞核.

Nakagawara等［3］在退化凋亡神經(jīng)母細(xì)胞瘤中報(bào)道了相似情況，由此推測胞核中的Caspase3可能和細(xì)胞凋亡有關(guān)，但具體機(jī)制不清.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析還提示，Caspase3在OLP上皮層細(xì)胞凋亡中起重要功能；而固有層淋巴細(xì)胞的生命活動更為復(fù)雜，TNFαTNFRI通路可能不僅僅介導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

腫瘤壞死因子（TNF）是由于其能引起腫瘤組織出血性壞死而得名，TNFα和TNFRI和相關(guān)分子結(jié)合，激活Caspase3而最終導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡［4］.Erdem等［5］檢測到OLP患者血清中的TNFα水平明顯比正常對照組高，SimarkMattsson等［6］發(fā)現(xiàn)OLP的T細(xì)胞有TNFαmRNA的表達(dá).本探究結(jié)果提示，OLP上皮細(xì)胞的凋亡異常可能是通過TNFαTNFRI介導(dǎo)的凋亡通路實(shí)現(xiàn)的，OLP固有層中的淋巴細(xì)胞表達(dá)TNFα，通過結(jié)合上皮細(xì)胞表面的TNFRI誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡；OLP固有層淋巴細(xì)胞的凋亡可能也是由TNFαTNFRI介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，但是由于TNFRI表達(dá)的減少，導(dǎo)致TNFα沒有足夠的受體結(jié)合而不能正常發(fā)揮功能，抑制了細(xì)胞凋亡，這也說明靶細(xì)胞表面TNFRI的質(zhì)和量直接影響TNFα的敏感性.沈麗佳等［7-8］的探究結(jié)果表明，OLP中的上皮細(xì)胞和固有層淋巴細(xì)胞都是TNFα潛在來源，當(dāng)OLP中上皮細(xì)胞表達(dá)TNFα及固有層淋巴細(xì)胞表達(dá)TNFRI減少時(shí)，TNFαTNFRI介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的凋亡途徑受阻，淋巴細(xì)胞得以“逃逸”正常的凋亡而聚集于OLP的固有層中.本實(shí)驗(yàn)中，OLP固有層淋巴細(xì)胞TNFα的表達(dá)還和其自身的AI呈負(fù)相關(guān)，因?yàn)門NFα和受體結(jié)合后，介導(dǎo)的不止是凋亡通路，還有可能激活NFκB通路，從而產(chǎn)生有利于細(xì)胞生存的信號，導(dǎo)致細(xì)胞增殖.這也說明了TNFαTNFRI細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的復(fù)雜性，其選擇死亡或生存信號的機(jī)制有待進(jìn)一步探索.

本探究中糜爛型OLP固有層淋巴細(xì)胞TNFα的表達(dá)明顯高于非糜爛組，說明TNFα在OLP中除了誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的凋亡外，還可能通過抑制細(xì)胞的生長或通過細(xì)胞毒功能，損傷上皮細(xì)胞，導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)上皮萎縮、糜爛等表現(xiàn).TNFα表達(dá)的高低對于OLP臨床診斷及治療的指導(dǎo)意義還有待進(jìn)一步探索.