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1材料與方法

1.1方法

1.1.1細胞培養及藥物處理：MKN1細胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養、傳代。實驗用對數生長期細胞。細胞培養至60%匯合度時，分別加入2μmol/L或10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理液，對照組使用不含5⁃Aza⁃CdR的普通完全培養液。每隔24h換液1次，培養72h后處理細胞用于后續的相關檢測。

1.1.2亞硫酸氫鹽修飾DNA和BSP反應：采用Blood＆CellCultureDNAMiniKit試劑盒，按說明書步驟提取各組細胞基因組DNA。取500ngDNA按照試劑盒說明進行亞硫酸氫鹽修飾及純化。使未甲基化的胞嘧啶（C）轉化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不變。以修飾后基因組DNA為模板，用GoT⁃aqDNA聚合酶進行bnip3基因啟動子擴增。用MethPrimer軟件設計甲基化引物，上游：5′⁃TTAAAGTGTTGAGATGAAAGATATG⁃3′，下游：5′⁃AATCCAAATCCAAATATCAAAATAC⁃3′，產物長度為288bp。反應條件為95℃10min，95℃30s、56℃30s、72℃30s進行35個循環，然后72℃延伸10min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，應用膠回收試劑盒回收，純化目的片段，連接pGEM⁃T載體，4℃孵育過夜。取6μL連接產物轉化JM109感受態大腸桿菌，藍白篩選陽性克隆，送菌液測序。

1.1.3RT⁃PCR檢測BNIP3基因表達：采用Axy⁃PrepTotalRNAMiniprepKit試劑盒提取各組細胞總RNA，逆轉成cDNA后進行PCR實驗，BNIP3引物序列：上游：5′⁃CCACCTCGCTCGCAGACACCAC⁃3′，下游：5′⁃GAGAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC⁃3′，長度為317bp。作為內參的人β⁃actin引物序列：上游：5′⁃CCAGATCATGTTTGAGACCT⁃3′；下游：5′⁃TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT⁃3′，長度為480bp。擴增反應條件：95℃5min變性，95℃復性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環，72℃延伸10min，4℃暫時保存。實驗重復3次。產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統（Tanon⁃2500R）拍照及分析表達情況。

1.1.4染色質免疫沉淀：采用ChIP試劑盒按說明書進行如下操作：用1%甲醛PBS交聯固定蛋白質－DNA復合物，加入交聯終止液5min，2500r/min、4℃離心10min，PBS洗脫2次；加裂解液冰上裂解5min，酶法消化切割至200~1000bp的染色質小片段；之后，染色質與DNMT1特異性抗體及DNA/Pro⁃teinGAgorose4℃顛轉過夜，洗脫蛋白/DNA復合物，純化回收DNA。針對BNIP3啟動子區的引物序列：上游：5′⁃CCGCGCCGCCTCCTCCGCCTCAC⁃3′；下游：5′⁃GCTCCGACCTCCGCTTTCCCACCGCC⁃3′。PCR擴增條件：95℃5min，95℃30s，59℃30s，72℃30s，72℃10min，30個循環。產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統（Tanon⁃2500R）拍照及分析表達情況。

1.2統計學分析數據用x±s表示，采用SPSS13.0統計軟件，組間比較采用t檢驗，甲基化率比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1MKN1細胞中BNIP3基因啟動子區的甲基化狀態

2.1.1BNIP3基因啟動子區CpG島序列分析：在ENSEMBLE上找到BNIP3基因啟動子區的原始序列，利用MethPrimer分析，按照“長度超過200bp，GC含量大于50%，CpG出現率（觀察值／預測值比例）≥0.6”的參數定義［8］，可以找到BNIP3基因啟動子區自轉錄起始點上游966bp至下游86bp之間長度為1052bp的CpG島。圖1為BSP法擬分析其中長288bp、含14個CpG位點的DN段。

2.1.2BSP結果：以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA為模板行PCR，將PCR擴增產物連接T載體，轉化增菌，PCR擴增鑒定陽性克隆。圖2為隨機挑取的5個克隆的菌液PCR鑒定結果，在約288bp處可見理想的目的條帶。

2.1.3測序結果分析：陽性克隆進一步測序，將亞硫酸氫鹽修飾后的序列與原序列進行對比，發現非CpG位點的“C”全部轉化為“T”，證明亞硫酸氫鹽修飾效果可信。擴增的BNIP3啟動子區片段包含有14個CpG位點，與原始BNIP3基因序列比對，各CpG位點甲基化概率分別為100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%、100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%。見圖3及圖4。

2.25⁃Aza⁃CdR對MKN1細胞中BNIP3表達的影響采用不同濃度5⁃Aza⁃CdR處理MKN1細胞，作用72h后，對照組、2μmol/L5⁃Aza⁃CdR處理組和10μmol/L5⁃Aza⁃CdR組的BNIP3mRNA相對表達量分別為0.389±0.018，0.515±0.024，0.839±0.014。10μmol/L5⁃Aza⁃CdR組的BNIP3mRNA表達量較對照組明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05），見圖5。

2.35⁃Aza⁃CdR對MKN1細胞中BNIP3基因啟動子甲基化的影響10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理細胞72h后，BNIP3基因啟動子甲基化狀態有所逆轉（圖6），啟動子區CpG位點甲基化率（74.2%±9.37%）與對照組（圖4）甲基化率（94.3%±19.80%）比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4BNIP3啟動子與DNMT1蛋白的結合用ChIP實驗檢測MKN1細胞中DNMT1與BNIP3啟動子區DNA的結合。結果顯示，在對照組可以檢測到DNMT1與BNIP3啟動子區DNA的結合，而10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理組與對照組相比DNMT1與BNIP3啟動子區DNA的結合明顯減少。見圖7。

3討論

DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的重要作用方式之一，指在DNA甲基化轉移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價鍵結合一個甲基基團。越來越多的研究表明，DNA甲基化在癌癥的發生機制中扮演重要角色。正常生理條件下，人類基因組中位于啟動子區、富含CpG二核苷酸的CpG島處于非甲基化狀態，抑癌基因啟動子區CpG島過度甲基化可誘導基因轉錄失活、表達沉默。BNIP3是Bcl⁃2家族中BH3⁃only亞家族的成員，具有BH3結構域和跨膜區，屬于促凋亡蛋白，通過促進線粒體通透性、轉運開放和線粒體的損傷誘導凋亡。Murai等［3］在66%的結直腸癌和49%的胃癌中檢測到BNIP3表達缺失。Abe等發現在幾乎所有的胰腺癌組織和50%的胰腺癌細胞系中未檢測到BNIP3的表達，其失活機制和DNA啟動子區高度甲基化相關。

目前，國內關于BNIP3基因的甲基化研究基本都局限于甲基化特異PCR法，此方法的特點是靈敏度高，但只能對引物序列中少量CpG位點進行分析，具有一定的局限性。所以關于腫瘤細胞中BNIP3基因啟動子區甲基化的具體位點還不清楚。BSP克隆測序法具有能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態的優勢，是公認的DNA甲基化分析的金標準［7］。本研究利用MethPrimer軟件分析了MKN1細胞中BNIP3基因CpG位點分布情況。結果顯示，BNIP3基因啟動子區自轉錄起始點上游966bp至下游86bp之間CpG位點分布密集，存在長度為1052bp的CpG島。本研究中利用BSP克隆測序法對BNIP3基因啟動子區中（+21bp~-267bp）長288bp、包含14個CpG位點的DN段進行甲基化水平的檢測，甲基化率為80%~100%。因此，首次明確了胃癌MKN1細胞中BNIP3基因啟動子區的甲基化位點，并檢測到這些CpG位點呈現高度的甲基化。

我們進一步用去甲基化藥物處理MKN1細胞，以明確啟動子甲基化與BNIP3基因表達的關系。5⁃Aza⁃CdR是一種高效的DNMT抑制劑，它可與DNMT不可逆性結合，具有較強去甲基化作用，使表觀遺傳學沉默的基因去甲基化，逆轉其惡性表型。本研究發現，對照組MKN1細胞中BNIP3表達缺失，10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR可誘導BNIP3mRNA表達明顯增加，BNIP3基因的啟動子區CpG位點甲基化概率較對照組明顯下降，提示胃癌MKN1細胞中BNIP3基因表達缺失與啟動子區高甲基化關系密切，該區域的CpG位點甲基化在調控基因轉錄中發揮重要作用。

DNA甲基化是由DNMT催化完成的。DNMT1催化甲基基團與胞嘧啶環的結合，維持DNA復制過程中的甲基化模式，在表觀遺傳修飾中發揮重要作用，其活性及表達水平與腫瘤發生密切相關。近年研究報道，DNMT1通過與靶基因啟動子DNA序列結合，介導DNA甲基化，調節基因表達［12，13］。我們推測DNMT1是否參與介導BNIP3發生DNA甲基化的機制。我們利用ChIP技術檢測DNMT1與BNIP3啟動子區DNA的結合狀態。結果顯示，MKN1細胞中DNMT1能與BNIP3啟動子區DNA結合。5⁃Aza⁃CdR能夠明顯抑制DNMT1與BNIP3啟動子的結合。提示5⁃Aza⁃CdR降低DNMT1與BNIP3啟動子區結合能力，部分逆轉BNIP3的甲基化狀態，是導致MKN1細胞中BNIP3表達上調的重要原因。

綜上所述，本研究首次明確了胃癌MKN1細胞中BNIP3基因啟動子區甲基化的具體位點，證實了MKN1細胞中BNIP3基因啟動子區CpG位點存在高甲基化，BNIP3基因表達受啟動子區DNA甲基化調控，甲基化的發生與DNMT1和BNIP3基因啟動子結合有關。揭示了BNIP3基因啟動子區DNA甲基化的機制，有助于從表觀遺傳學角度揭示胃癌的發病機制，為胃癌的基因治療提供理論基礎。

作者：沈薇劉坤隋璐鄒丹胡金瑤單位：沈陽醫學院病理生理教研室生理教研室2012級醫學影像專業