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1材料和方法

1.1半定量RT-PCR檢測(cè)VEGF的表達(dá)提取RNA方法如下：將50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，倒掉培養(yǎng)液，加入1mLTrizol。將培養(yǎng)瓶內(nèi)Trizol吸取至1mLEP管中，室溫靜置5min。加入200μL氯仿，劇烈搖晃數(shù)次，室溫靜置5min，11000轉(zhuǎn)/分，4℃離心15min。取上清液加入新1mLEP管中，加入500μL異丙醇后搖晃數(shù)次。室溫靜置10min，11000轉(zhuǎn)/分，4℃離心10min。棄上清液加1mL75%乙醇后混勻。7500轉(zhuǎn)/分，4℃離心5min。棄上清液風(fēng)干，加入20μL無RNA酶水，58℃加溫10min，-70℃凍存。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，50μL反應(yīng)體系PCR反應(yīng)。VEGF（682bp）引物序列：5''''ggctctagatcgggcctccgaaaccat3''''和5''''ggctctagagcgcagagtctcctcttc3'''';β-actin（434bp）引物序列：5''''tgtgcccatctacgaggggtatgc3''''和5''''ggtacatggtggtgccgccagaca3''''。反應(yīng)條件：95°C變性，30s；VEGF63.5°C退火，27循環(huán)，45s；或β-actin57°C退火，25循環(huán)，30s；72°C延伸30s。收集PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖電泳。凝膠成像系統(tǒng)半定量分析。以上結(jié)果均重復(fù)3次。

1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量指標(biāo)用（x軃±s）表示，ANOVA方差分析，student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性活力檢測(cè)ACC-M和ACC-2細(xì)胞在不同濃度的SNAP作用4h后細(xì)胞的活力，在0μmol/L~500μmol/L濃度的SNAP作用下，細(xì)胞的活力均保持在88%以上（表1）。經(jīng)濃度100ng/mL的LPS預(yù)刺激12h后，用500μmol/L的SNAP分別作用不同時(shí)間ACC-M和ACC-2細(xì)胞活力，其活力均保持在86%以上。

2.2不同濃度SNAP對(duì)ACCs細(xì)胞中VEGF的mRNA表達(dá)水平的影響半定量RT－PCR的結(jié)果表明（圖1、圖2），在31.25μmol/LSNAP刺激下ACC-M和ACC-2細(xì)胞中VEGF的mRNA平均水平顯著升高，為2.32±0.10和2.14±0.15，分別是對(duì)照組細(xì)胞（0μmol/L）mRNA水平的4.14倍和6.90倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.01）。隨著SNAP刺激濃度升高，mR－NA水平逐漸回落：62.5μmol/LSNAP仍可明顯上調(diào)VEGF的mRNA水平（P<0.01），但不及31.25μmol/L的SNAP顯著；125μmol/L和250μmol/LSNAP對(duì)VEGFmRNA影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而500μmol/LSNAP則顯著下調(diào)ACCs細(xì)胞中VEGF的mRNA水平（P<0.01），僅為基礎(chǔ)mRNA水平的0.23倍和0.17倍（表3）。One－WayANOVA檢驗(yàn)和Student–Newman-Keuls檢驗(yàn)比較31.25μmol/L、62.5μmol/L及500μmol/L濃度組與0對(duì)照組mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3SNAP時(shí)間依賴性抑制100ng/mLLPS誘導(dǎo)的VEGF的表達(dá)水平隨著500μmol/LSNAP作用時(shí)間的延長，ACCs細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的VEGFmRNA水平顯著下降（P<0.01）；當(dāng)500μmol/LSNAP作用4h后，僅可檢測(cè)到極微弱的VEGFmRNA條帶，其mRNA的平均表達(dá)水平顯著低于LPS誘導(dǎo)12h后SNAP作用0小時(shí)組的mRNA水平（表4）。半定量RT－PCR的結(jié)果（見圖3、圖4）。One－WayANOVA檢驗(yàn)和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)比較其他各時(shí)間組與0對(duì)照組mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

一氧化氮（NO）是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，其生成依賴于細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮合成酶（nitricoxidesynthaseenzyme，NOS）。它能通過傳遞電子的反應(yīng)參與機(jī)體的氧化還原反應(yīng)，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要生理作用。目前越來越多的研究證實(shí)，NO在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中NOS的高表達(dá)，能抑制腫瘤的生長和局部浸潤。而另一些研究表明，NO具有促進(jìn)腫瘤血管發(fā)生和局部侵襲性。不同的NO濃度是其在腫瘤調(diào)控中發(fā)揮著截然相反作用的主要原因。高濃度的NO在生物體內(nèi)形成過氧亞硝基（OONO-）和N3O2，能氧化或硝化DNA導(dǎo)致DNA單鏈斷裂、抑制DNA的合成以及核苷酸還原酶的活性，并能抑制體內(nèi)的磷酸化信號(hào)通路的活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。而低濃度的NO被證實(shí)與腫瘤微血管發(fā)生、腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此將NO作為腫瘤治療的重要手段的同時(shí)，應(yīng)充分認(rèn)識(shí)低濃度的NO對(duì)腫瘤促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)證明NO的供體SNAP對(duì)ACCs細(xì)胞有著雙向調(diào)控作用，當(dāng)SNAP的刺激濃度在31.25μmol/L時(shí)能顯著上調(diào)血管發(fā)生相關(guān)因子的表達(dá)，而當(dāng)SNAP的刺激濃度在500μmol/L時(shí)血管發(fā)生相關(guān)因子的表達(dá)被有效抑制。

大量研究證明，NO誘導(dǎo)的血管發(fā)生相關(guān)因子的異常表達(dá)，在促進(jìn)腫瘤微血管發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用。Jenkins等[8]首次報(bào)道在人腫瘤細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入iNOScDNA閱讀框后腫瘤生長加速，且伴隨著大量微血管的發(fā)生。Ambs等的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在異種種植瘤內(nèi)NO能誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增高，促進(jìn)腫瘤微血管發(fā)生。可見在ACC中，相對(duì)低濃度的NO可能通過上調(diào)VEGF表達(dá)來促進(jìn)腫瘤微血管發(fā)生。

隨著對(duì)NO的抗腫瘤特性研究的逐漸深入，NO被視為一種頗具前景的腫瘤細(xì)胞殺傷因子，然而NO對(duì)腫瘤調(diào)控的雙向效應(yīng)增加了其作為抗腫瘤藥物的復(fù)雜性。因此研究不同濃度NO對(duì)ACCs細(xì)胞的調(diào)控作用和調(diào)控途徑，將更加有利于研究其對(duì)ACCs的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SNAP濃度為31.25μmol/L時(shí)，ACCs細(xì)胞中VEGF表達(dá)顯著增高。當(dāng)SNAP濃度為500μmol/L時(shí)，LPS誘導(dǎo)的VEGF的高表達(dá)被明顯抑制，且具有時(shí)間依賴性。提示500μmol/LSNAP能有效抑制ACCs血管發(fā)生相關(guān)因子的表達(dá)，提示高濃度NO可能在抑制ACCs血管發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用。

作者：陳錦袁蘇健單位：長江航運(yùn)總醫(yī)院武漢腦科醫(yī)院口腔科