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《中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)雜志》2014年第八期

1材料與方法

1．1試劑、菌株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器萘啶酮酸（Nalidixicacid），溴化乙錠（EB）均為Sigma公司產(chǎn)品。rTaqDNA聚合酶等PCR反應(yīng)試劑均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌CICC21530由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。普通昆明小鼠，5周齡，雌性：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。超凈工作臺(tái)由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。Bio－RadModel1000／500型電泳儀：Bio－Rad公司生產(chǎn)。2720ThermalCyclerPCR擴(kuò)增儀由美國(guó)ABI公司生產(chǎn)。ChampGel全自動(dòng)凝膠圖像處理系統(tǒng)由北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)。

1．2EHECO157∶H7菌株DNA模板的提取將EHECO157∶H7菌株接種在5mLBHI液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩18h。吸取1．5mLBHI培養(yǎng)基，以10000r／min離心2min。菌泥加入100μL無(wú)菌蒸餾水孵育10min，放置在冰盒上冷卻5min，混合物以10000r／min離心2min。移除懸液并于－20℃儲(chǔ)存，作為DNA模板用于之后的PCR分析［6］。

1．3EHECO157∶H7菌株毒力基因的檢測(cè)利用提取的分離菌株DNA模板分別對(duì)stx1、eaeA、hly、stx2、F4、k99、F17共7種毒力基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)引物見(jiàn)表1。以標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌CICC21530作為陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物在10g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（1×TAE，EB染色，20min，120V），凝膠影像用凝膠成像儀進(jìn)行照相。

1．4大腸桿菌O157∶H7菌株的毒力試驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在無(wú)菌環(huán)境下，飼喂滅菌鼠糧和水。選擇36只雌性小白鼠（體重20g±5g），隨機(jī)將其分成6組，小鼠在腹腔注射前第2天飲水中添加萘啶酮酸（50μg／mL），接種前第24小時(shí)禁食，每只小鼠腹腔接種菌液0．5mL，濃度梯度為1．0×1010、1．0×109、1．0×108、1．0×107、1．0×106CFU／mL，共5個(gè)梯度。對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。根據(jù)各組的死亡情況，依照改良寇氏法計(jì)算最小致死量（MLD）與半數(shù)致死量（LD50）。

1．5大腸桿菌O157∶H7菌株的致病性試驗(yàn)將大腸桿菌O157∶H7菌株接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃振蕩24h，倍比稀釋后，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，細(xì)菌懸液用生理鹽水稀釋到1．0×1010CFU。小鼠在腹腔注射前第2天飲水中添加萘啶酮酸（50μg／mL），在接種前第24小時(shí)禁食，每只小鼠腹腔接種菌液0．2mL（1．0×1010CFU），對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。接種后24h內(nèi)觀察各組小鼠的死亡情況。

1．6患病小鼠的組織學(xué)檢查小鼠被處死之后，立即解剖，分離肺、腎、腸道、脾、心臟和肝，并檢查顯而易見(jiàn)的病理變化。對(duì)病理組織在含40mL／L甲醛的PBS中固定24h，進(jìn)行脫水處理，石蠟包埋，做4μm厚的連續(xù)切片，HE染色并用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

2結(jié)果

2．1分離菌株毒力基因的檢測(cè)毒力基因的PCR檢測(cè)結(jié)果表明，stx1、eaeA、hly三種毒力基因均為陽(yáng)性（見(jiàn)圖1）。

2．2大腸桿菌O157∶H7菌株的毒力試驗(yàn)小鼠腹腔注射0．5mL（1．0×1010CFU）大腸桿菌O157∶H7，18h后前三組開(kāi)始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，注射后第48小時(shí)第4組出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，第5組沒(méi)有死亡現(xiàn)象（見(jiàn)表2）。根據(jù)各組小鼠的死亡數(shù)計(jì)算出的最小致死量和半數(shù)致死量分別為5．0×106CFU和7．9×107CFU。

2．3大腸桿菌O157∶H7菌株的致病性試驗(yàn)小鼠在接種后第7小時(shí)出現(xiàn)全身癥狀，包括嗜睡、厭食、脫水、無(wú)尿、被毛散亂、呼吸急促，但沒(méi)有發(fā)展為神經(jīng)癥狀，至第18小時(shí)全部死亡。對(duì)照組小鼠無(wú)異常癥狀。死亡小鼠剖檢后病變主要為：肺、心臟、腎、肝均有不同程度的腫大或出血；肺部切面呈暗紅色，小腸有明顯的黃色黏稠積液，腸黏膜充血，腸腔擴(kuò)張，腸壁變薄、透明。臟器細(xì)菌回歸檢測(cè)，陽(yáng)性率為100％。

2．4組織學(xué)檢查致病小鼠的心臟腫大，心耳淤血。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，心肌纖維斷裂，肌細(xì)胞破裂。間質(zhì)充血，心臟動(dòng)、靜脈淤血（見(jiàn)圖2A）。肝眼觀出血點(diǎn)明顯，淤血，體積增大，切面脆弱呈顆粒狀。組織學(xué)檢查時(shí)肝門(mén)靜脈淤血嚴(yán)重，上皮細(xì)胞壞死、脫落，少量肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞質(zhì)溶解，間質(zhì)有紅細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖2B）。小鼠脾暗紅色，病理組織學(xué)檢查時(shí)可見(jiàn)有多量紅細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖2C）。肺眼觀淤血，顏色變深，有出血點(diǎn)，腫大。病理組織學(xué)檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死，核仁溶解，管腔中觀察到脫落的上皮細(xì)胞。肺泡擴(kuò)張，充血，肺泡隔增厚，間質(zhì)淤血（見(jiàn)圖3A）。腎顏色蒼白，水腫，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腎小球上皮細(xì)胞腫脹、破裂，細(xì)胞變性但未觀察到壞死，細(xì)胞質(zhì)疏松，腎小管細(xì)胞腫脹，管腔變窄，細(xì)胞破裂（見(jiàn)圖3B）。小腸腸壁變薄，透明、腫大有氣泡，血管充血，腸腔內(nèi)充滿(mǎn)黃色液體，尤其以十二指腸最為嚴(yán)重。十二指腸病理組織學(xué)觀察可見(jiàn)，固有層變薄，局部上皮細(xì)胞壞死、脫落，杯狀細(xì)胞破碎，胞質(zhì)疏松，細(xì)胞脫落，無(wú)完整結(jié)構(gòu)，可以觀察到有少量細(xì)胞核溶解，輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖3C）。對(duì)照組小鼠未觀察到病理組織學(xué)變化。

3討論

據(jù)WHO估計(jì)，1982－2005年美國(guó)每年有250人死于大腸桿菌O157∶H7，英國(guó)、法國(guó)等國(guó)都有出現(xiàn)人感染后的死亡現(xiàn)象［9］。O157∶H7具有較強(qiáng)的感染力，一般大腸桿菌需要100萬(wàn)個(gè)活菌才可引起發(fā)病，而O157∶H7只需100到200個(gè)活菌即可突破胃酸屏障，引發(fā)感染。各年齡段人群對(duì)O157∶H7都易感，但兒童和老年人最易發(fā)病且癥狀較為嚴(yán)重。臨床資料統(tǒng)計(jì)表明，EHEC的潛伏期通常是3～4d，感染患者大多急性發(fā)病，常突然發(fā)生劇烈腹痛和非血性腹瀉，數(shù)天后出現(xiàn)血性腹瀉，低熱或不發(fā)熱，表現(xiàn)為水樣便、黏液便或膿血便。大腸桿菌O157∶H7具有多種毒力因子，但在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，毒力因子也存在從其他菌株獲取或缺失的現(xiàn)象，導(dǎo)致部分大腸桿菌O157∶H7毒力的改變。喪失毒力的大腸桿菌O157∶H7在生化特性、血清學(xué)試驗(yàn)中與其他大腸桿菌O157∶H7的表型幾乎完全一致。因此，傳統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查并不能展現(xiàn)出大腸桿菌O157∶H7的毒性與威脅程度，對(duì)分離菌株進(jìn)行毒力因子的檢測(cè)具有重要意義。人類(lèi)感染大腸桿菌O157∶H7后，發(fā)病與sstx1、tx2等致病基因有關(guān)。愛(ài)爾蘭、西班牙、芬蘭、阿根廷等經(jīng)常有大腸桿菌O157∶H7的暴發(fā)或散發(fā)，分離的大腸桿菌O157∶H7菌株大部分?jǐn)y帶stx1、stx2、eaeA基因。本試驗(yàn)在采取的病料中成功地分離出1株出血性大腸桿菌O157∶H7。根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道，筆者主要針對(duì)stx1、stx2、eaeA和hly等4種毒力基因以及F4、F17、K99菌毛進(jìn)行檢測(cè)。

PCR檢測(cè)結(jié)果表明，該菌株含有stx1、hly、eaeA三種毒力基因，從而使該菌株有一定的致病性。可見(jiàn)，在不同條件下分離的出血性大腸桿菌O157∶H7含有的毒力基因的種類(lèi)有所不同，并且產(chǎn)生不同的致病能力。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，成年的IQI、BALB／c、昆明小鼠等對(duì)O157∶H7均不易感［11］。陳亢川等［12］以大腸桿菌O157∶H7經(jīng)腹腔注射感染小鼠，出現(xiàn)了臨床癥狀及死亡。孫洋等使用絲裂霉素和萘啶酮酸處理的小鼠，經(jīng)口服途徑感染O157∶H7，出現(xiàn)了主要病理變化和部分臨床癥狀。但這些試驗(yàn)均未摸索出大腸桿菌O157∶H7的半數(shù)致死量，為后續(xù)的研究帶來(lái)了不便。本試驗(yàn)在小鼠飲水中加入萘啶酮酸（50μg／mL），萘啶酮酸抑制了小鼠體內(nèi)的正常菌群，增強(qiáng)了分離菌株對(duì)小鼠的易感性。經(jīng)過(guò)腹腔注射活菌的小鼠在1～5d內(nèi)發(fā)病、死亡，利用改良寇氏法測(cè)算出大腸桿菌O157∶H7的半數(shù)致死量要比謝運(yùn)冰等報(bào)道的偏高，可能與環(huán)境或其他原因有關(guān)。

LD50的測(cè)定使其與其他不同菌株或疫苗菌株的比較有了一個(gè)準(zhǔn)確的劑量參照，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。EHECO157∶H7感染所引起的經(jīng)典的組織病理學(xué)變化包括腸黏膜固有層的出血和水腫，結(jié)腸活檢標(biāo)本會(huì)顯示出中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，典型的人腎組織病理學(xué)變化包括腎小球內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和血小板及纖維素在腎小球的沉積。有報(bào)道稱(chēng)，用EHEC感染無(wú)菌豬、鏈霉素處理的老齡鼠、幼兔可以引起消化道病變及神經(jīng)系統(tǒng)疾病或者死亡，然而，這些動(dòng)物模型并未觀察到出血性結(jié)腸炎和腎小球的病理變化［15］。本研究中患病小鼠癥狀顯示腎病變以水腫和無(wú)尿?yàn)橹鳎I的病理變化主要集中于腎小管和腎小球上皮細(xì)胞破裂，胞質(zhì)疏松。感染引起腸管各層結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，黏膜壞死、脫落，血管充血，腸壁變薄，細(xì)胞脫落，無(wú)完整結(jié)構(gòu)，尤其以十二指腸最為嚴(yán)重。結(jié)腸未出現(xiàn)顯而易見(jiàn)的病理變化，可能與使用萘啶酮酸處理小鼠有關(guān)?；疾⌒∈蟪霈F(xiàn)呼吸急促，剖檢后發(fā)現(xiàn)肺有出血點(diǎn)、腫大，病理變化顯示支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死，肺泡擴(kuò)張、充血、出血。本研究結(jié)果表明，幼齡小鼠經(jīng)萘啶酮酸處理，提高了幼齡小鼠對(duì)EHECO157∶H7的敏感性，從而觀察到了明顯的病理學(xué)變化，為進(jìn)一步研究EHECO157∶H7的致病特性以及毒力因子在致病特性中所發(fā)揮的作用奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

4結(jié)論

EHECO157∶H7黑龍江分離株毒力較強(qiáng)，可造成小鼠肺、肝、腎、心臟、脾以及小腸出現(xiàn)不同程度的出血及細(xì)胞變性、壞死，其中對(duì)肺泡、腎小球、腎小管以及十二指腸的破壞力最為嚴(yán)重。

作者：張力國(guó)盧婷趙明禮梁偉峰孫冬冬孫思超周?chē)?guó)輝師東方于力劉云單位：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所