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摘要:目的探討精芪燕面方(JQYM)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血壓升高及心肌損傷的干預(yù)效果,為藥食同源的中藥組方防治高血壓的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法采用SHR雄性大鼠作為高血壓動(dòng)物模型,分為SHR模型組、JQYM組、坎地沙坦酯片組(Can組),以同周齡同源WistarKyoto(WKY)雄性大鼠為正常對(duì)照組,每組各12只。各組大鼠從6周齡起開始治療干預(yù)14周,于20周齡分析血壓、旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間、心臟組織病理改變及腫瘤壞死因子α(TNFα)、鈉尿肽(ANP)基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與正常對(duì)照組比較,SHR模型組收縮壓及舒張壓隨著周齡變化顯著升高;與SHR模型組比較,JQYM組SHR大鼠收縮壓及舒張壓水平顯著降低(P<0.05)。與SHR模型組比較,JQYM組旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。與SHR模型組比較,JQYM組及Can組心肌損傷程度顯著減輕(P<0.05)。與SHR模型組比較,Can組及JQYM組心肌細(xì)胞橫截面面積縮小,且JQYM組優(yōu)于Can組(P<0.05)。與SHR模型組比較,Can組及JQYM組TNFα及ANPmRNA表達(dá)水平顯著降低,且JQYM組較Can組降低明顯(P<0.05)。結(jié)論JQYM干預(yù)能夠顯著降低SHR大鼠收縮壓及舒張壓水平,延長(zhǎng)旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間,減輕高血壓相關(guān)心肌損傷及心肌細(xì)胞肥大樣改變,降低心臟組織中TNFα及ANPmRNA的表達(dá)水平。JQYM具有顯著的抗SHR大鼠血壓升高的效應(yīng),同時(shí)對(duì)高血壓相關(guān)心肌損傷及心肌細(xì)胞肥大等病理改變具有顯著的干預(yù)效應(yīng)。

關(guān)鍵詞:高血壓;精芪燕面方;心肌損傷;心肌保護(hù)作用;自發(fā)性高血壓大鼠

高血壓(hypertension)是以體循環(huán)動(dòng)脈壓增高為主要表現(xiàn),可伴有心、腦、腎等器官功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征,在臨床上有高致殘率和高致死率的特點(diǎn)[1]。而收縮壓/舒張壓(SBP/DBP)每降低10/5mmHg(1mmHg=0.133kPa)可顯著減少所有主要心血管結(jié)局的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)[2]。2017年11月14日美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC)和美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA)聯(lián)合2017版高血壓臨床實(shí)踐指南,提出將高血壓的診斷從140/90mmHg下降至130/80mmHg,將目標(biāo)血壓降低病人的獲益將增大[3]。目前降壓藥物主要為5大類,但因多方面原因,高血壓控制率仍處于較低水平,患病率仍在持續(xù)上升[4]。高血壓的早期防治和長(zhǎng)期防治戰(zhàn)略得到了學(xué)術(shù)界的共識(shí),中醫(yī)藥作為輔助藥物治療高血壓,在調(diào)節(jié)機(jī)體整體平衡、控制血壓水平穩(wěn)定等方面體現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[5],在平穩(wěn)降壓的同時(shí),能夠有效改善眩暈、頭痛等臨床癥狀,并減少并發(fā)癥的發(fā)生,同時(shí)長(zhǎng)期防治中藥物的副作用也是一個(gè)主要的障礙,因此藥食同源中藥研究是應(yīng)對(duì)高血壓長(zhǎng)期防治的優(yōu)勢(shì)途徑,目前中醫(yī)臨床探索較多,但深入細(xì)致的研究缺乏。作為藥食同源的中醫(yī)藥處方,有潛在心肌保護(hù)作用。本研究選擇自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneouslyhyperten-siverats,SHR),觀察精芪燕面方(JQYM)在降低SHR血壓的同時(shí),對(duì)行為學(xué)表現(xiàn)(旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間)及心臟組織腫瘤壞死因子α(TNFα)、鈉尿肽(ANP)mRNA表達(dá)水平及心肌損傷的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)4周齡SHR和WistarKyo-to(WKY)雄性大鼠,購(gòu)自北京維通利華有限公司。

1.2藥物與試劑

精芪燕面方所含中藥材購(gòu)自上海康橋中藥飲片有限公司:夏枯草(批號(hào)161114)、黃芪(批號(hào)161207)、制黃精(批號(hào)161201)、桑葉(批號(hào)161101)、生山楂(批號(hào)161022);坎地沙坦酯片(8mg):國(guó)藥準(zhǔn)字J20150085,日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:日本Takara,寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn);SYBRGreen熒光染料:瑞士Roche公司生產(chǎn)。

1.3主要儀器

智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)BP98ASeries[北京軟隆(Softron)生物技術(shù)有限公司];平衡旋轉(zhuǎn)儀(JD01GSZ型,上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠);自動(dòng)脫水機(jī),石蠟包埋機(jī),石蠟切片機(jī)及正置顯微鏡(LEICA);PCR定量測(cè)試儀(Eppendorf);實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(LightCyclerRL480IIRoche)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組采用4周齡SHR雄性大鼠36只為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為SHR模型組,中藥治療組(JQYM組)、坎地沙坦酯片組(Can組),每組各12只。以同周齡WKY雄性大鼠12只為正常對(duì)照組。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,并均給予標(biāo)準(zhǔn)化飲食,不限其活動(dòng),維持其飼養(yǎng)溫度及相對(duì)濕度以保證飼養(yǎng)環(huán)境。1.4.2給藥方式及劑量JQYM組、Can組于6周齡時(shí)分別灌服精芪燕面方、坎地沙坦酯片;SHR模型組與正常對(duì)照組則灌胃等劑量的飲用水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)至20周齡。Can組所用坎地沙坦酯采用pH值為6.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解,按照人體劑量換算以1mg/kg的劑量灌胃,每次2mL,每日1次;JQYM組大鼠用量按人體用量6.3倍換算給藥,稱取相應(yīng)草藥(夏枯草30g,黃芪30g,制黃精15g,桑葉15g,生山楂15g),使用自動(dòng)煎藥鍋進(jìn)行煎煮,煎煮后取藥汁,按每只大鼠灌胃2mL計(jì)算所需藥汁總量,進(jìn)行加熱濃縮定量。1.4.3血壓測(cè)量所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每2周測(cè)量其收縮壓及舒張壓水平。所有待測(cè)血壓動(dòng)物,當(dāng)日09:00灌胃,測(cè)量灌胃后1h血壓。測(cè)量過程完全嚴(yán)格按血壓計(jì)操作手冊(cè)規(guī)范進(jìn)行操作,首先將測(cè)量裝置連接好并開啟保溫裝置,溫度控制在37.0℃~38.5℃。然后將大鼠放在保溫裝置中固定并預(yù)熱約15min后,開始測(cè)量大鼠安靜清醒狀態(tài)尾動(dòng)脈收縮壓,連續(xù)測(cè)量3次取其平均值,正式測(cè)量血壓之前每天進(jìn)行測(cè)量血壓訓(xùn)練,連續(xù)訓(xùn)練7d[6]。1.4.4旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間測(cè)量對(duì)大鼠的平衡耐受時(shí)間進(jìn)行測(cè)量,把大鼠安置在轉(zhuǎn)速為60r/min的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)之上,觀察大鼠自旋轉(zhuǎn)到跌落平臺(tái)的時(shí)間并進(jìn)行記錄,2min后,若大鼠仍然在平臺(tái)上,就停止測(cè)試,所有大鼠的測(cè)試時(shí)間統(tǒng)一規(guī)定在10:00~11:00。觀察大鼠掉落平臺(tái)時(shí)間來判斷大鼠的旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間。1.4.5心臟組織蘇木素伊紅(HE)染色所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于最后一次灌胃測(cè)壓后,次日腹腔注射10%的水合氯醛麻醉,解剖取材。每組隨機(jī)選取6只大鼠,取心臟組織,用4%多聚甲醛固定,24h后自動(dòng)脫水機(jī)脫水、石蠟包埋。主要采用石蠟切片,HE染色,顯微鏡下觀察病理形態(tài)的變化。大鼠心臟病理切片,每隔10張選取1張進(jìn)行HE染色,顯微拍攝,評(píng)分。1.4.6心肌細(xì)胞肥大評(píng)價(jià)每只動(dòng)物每張病理切片,選擇病變部位附近30個(gè)~50個(gè)心肌細(xì)胞,使用LeicaQwinV3分析軟件計(jì)算每個(gè)心肌細(xì)胞的橫截面積,取其平均值以代表該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心肌細(xì)胞橫截面面積,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.4.7RNA抽提及TNFα、ANP表達(dá)檢測(cè)每組取6只大鼠心臟組織靠近心尖部下1/3予以檢測(cè)TNFα及ANPmRNA相對(duì)表達(dá)。βactin作為內(nèi)參,βactin引物:上游5′CACCCGCGAGTACAACCTTC3′,下游5′CCCATACCCACCATCACACC3′;TNFa引物:上游5′ACAAGGAGGAGAAGTTCCCAAAT3′,下游5′CTTGTCACTCGAGTTTTGAGAAGA3′;ANP引物:上游5′CTGGGACCCCTCCGATAGAT3′,下游5′TTCGGTACCGGAAGCTGTTG3′。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,使用單因素方差(onewayANOVA)分析,組間比較采用LSD方法。采用非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)有序分類資料各組心肌損傷評(píng)分進(jìn)行Ridit分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠收縮壓變化情況

與正常對(duì)照組比較,SHR模型組收縮壓隨著周齡的增加,其收縮壓持續(xù)上升。與SHR模型組比較,Can組收縮壓顯著降低(P<0.05)。與SHR模型組比較,JQYM組灌胃4周后(8周齡)開始有顯著降壓作用,一直到20周齡,持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮控壓作用(P<0.05)。詳見表1。

2.2各組大鼠舒張壓變化情況

與正常對(duì)照組比較,SHR模型組舒張壓顯著升高。與SHR模型組比較,Can組舒張壓水平顯著降低(P<0.05);JQYM組于第14周齡、18周齡、20周齡時(shí),舒張壓水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。2.3各組大鼠旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間比較與正常對(duì)照組比較,SHR模型組旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Can組旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間與SHR模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。JQYM組旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間較SHR模型組、Can組顯著延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

2.4各組大鼠心肌損傷程度比較

高倍鏡下,正常對(duì)照組心肌組織未見明顯病理性改變;SHR模型組可見心肌組織多發(fā)性灶性壞死,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);JQYM組僅見少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且對(duì)心肌組織的保護(hù)作用優(yōu)于SHR模型組。詳見圖2。根據(jù)心肌損傷受累面積、損傷程度等,分別標(biāo)記為“-”“-/+”“+”“++”“+++”“++++”,其中“-”代表無(wú)明顯損傷,“++++”則為存在極重度損傷。與SHR模型組比較,JQYM組與Can組心肌損傷程度顯著降低(P<0.05)。詳見表3。

2.5各組大鼠心肌細(xì)胞橫截面面積比較

為進(jìn)一步探索JQYM對(duì)高血壓心臟保護(hù)效應(yīng)的研究,在高倍鏡下分別選取30個(gè)~50個(gè)心肌細(xì)胞,使用LeicaQwinV3分析軟件計(jì)算每個(gè)心肌細(xì)胞的橫截面積,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與正常對(duì)照組比較,SHR模型組大鼠心肌組織平均橫截面面積顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與SHR模型組比較,Can組及JQYM組心肌橫截面面積顯著降低(P<0.05),且JQYM組較Can組降低更明顯(P<0.05)。詳見圖3、圖4。各組大鼠心肌細(xì)胞橫截面面積比較2.6各組大鼠心臟組織TNFα及ANPmRNA表達(dá)水平比較分別將正常對(duì)照組大鼠心臟組織中TNFα及ANPmRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1。與正常對(duì)照組比較,SHR模型組大鼠心臟組織中TNFα及ANPmRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與SHR模型組比較,Can組和JQYM組心臟組織中TNFα及ANPmRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05);且JQYM組較Can組TNFα及ANPmRNA表達(dá)降低明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖5、圖6。與SHR模型組比較,*P<0.05;與正常對(duì)照組比較,#P<0.05;JQYM組與Can組比較,△P<0.05圖5各組大鼠心臟組織TNFαmRNA表達(dá)水平比較

3討論

高血壓屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等病證范疇,張騰教授認(rèn)為早中期高血壓病變主要在肝,治療應(yīng)注重隨證從肝論治,重在清肝益腎祛風(fēng),通過在臨床長(zhǎng)期治療大量高血壓病總結(jié)出該法則有效。本研究在前期臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出清肝益腎祛風(fēng)法則組合的方藥不僅能降低血壓,而且能夠保護(hù)心、腦、腎靶器官損傷,改善臨床癥狀,提高生活質(zhì)量,取得較好的臨床效果[78]。本課題組為進(jìn)一步推廣中醫(yī)藥防治高血壓病,以清肝益腎祛風(fēng)為組方精髓,選擇藥食同源的中藥組合成精芪燕面方(夏枯草30g,黃芪30g,制黃精15g,桑葉15g,生山楂15g)。夏枯草又名燕面(《別錄》),具有清肝火明目[9];黃芪與制黃精益氣養(yǎng)陰益腎[1011];桑葉輔助祛風(fēng)清肝[12];生山楂消食健胃,行氣散瘀[13],諸藥組合為藥食同源方并選擇自發(fā)性高血壓大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以期獲得更充實(shí)的數(shù)據(jù)為其推廣和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。SHR是目前國(guó)際公認(rèn)最接近于人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型,是基礎(chǔ)研究及藥物篩選的首選[14]。除了血壓值指標(biāo)外,本研究納入旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間這一指標(biāo)。通過實(shí)驗(yàn)研究提示精芪燕面方能顯著延長(zhǎng)旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間,且顯著優(yōu)于坎地沙坦,在證實(shí)了其穩(wěn)定的降壓作用基礎(chǔ)上又突顯了中藥改善癥狀的優(yōu)勢(shì)作用。TNFα是一種促炎性細(xì)胞因子,主要由巨噬細(xì)胞、CD4淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞激活,可促進(jìn)白介素1(IL1)和白介素6(IL6)的釋放,加重高血壓進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)JQYM可顯著降低SHR大鼠心肌組織中TNFα水平,提示JQYM降壓的作用可能與降低心肌組織中TNFα的水平,進(jìn)而改善炎癥水平有關(guān)。ANP是一類由心房肌細(xì)胞合成、釋放,在正常生理情況下處于低表達(dá)狀態(tài)的肽類激素。在病理情況下,或因機(jī)械損傷或因高血壓容量狀態(tài)下,心房肌釋放ANP增加。本研究結(jié)果顯示,JQYM降低SHR大鼠心臟組織中ANP表達(dá),可能與其顯著改善心肌損傷的作用有關(guān)。綜上所述,JQYM對(duì)SHR大鼠有顯著降壓作用,雖然降壓水平不及坎地沙坦酯片,但作用穩(wěn)定持久,且其對(duì)SHR大鼠所致的心肌損傷保護(hù)作用優(yōu)于坎地沙坦酯片。高血壓及其靶器官損傷是危害人類健康的最主要隱形殺手,防治工作具有長(zhǎng)期性、持久性,藥食同源處方以其安全第一且作用穩(wěn)定的巨大優(yōu)勢(shì)一定會(huì)發(fā)揮其積極作用,為人類健康事業(yè)做出貢獻(xiàn)。

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作者：唐曉婷 唐新淼 崔金剛 杜霄燁 陳瑜 張騰 單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院