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據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前中國(guó)種植的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉面積已占植棉總面積的70％以上［1］。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的迅速發(fā)展，主要是由于其能有效地減輕棉鈴蟲等相關(guān)害蟲的危害，減少農(nóng)藥用量。但國(guó)內(nèi)外一致認(rèn)為轉(zhuǎn)Bt基因棉花的抗蟲性表現(xiàn)不穩(wěn)定。其中不良的環(huán)境對(duì)抗蟲性表達(dá)具有較大的影響，即Bt棉在不良的環(huán)境條件下表現(xiàn)抗蟲性顯著下降或不抗蟲現(xiàn)象［2－3］。棉花生育過(guò)程經(jīng)常受高溫脅迫的影響，而盛鈴期又是棉花產(chǎn)量形成的主要時(shí)期，因此筆者通過(guò)研究棉花生育期高溫對(duì)棉花鈴殼中Bt蛋白表達(dá)的效應(yīng)，并探討與Bt蛋白的表達(dá)密切相關(guān)的氮代謝過(guò)程所受的影響，從而為Bt安全應(yīng)用提供生理基礎(chǔ)。

1材料和方法

1．1試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)于2010－2011年在揚(yáng)州大學(xué)江蘇省遺傳栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。以不同品種類型的棉花品種泗抗1號(hào)（常規(guī)棉）、泗抗3號(hào)（雜交棉）為供試材料，分別以SK－1和SK－3表示。棉花為盆栽，在盛鈴期（8月15日），應(yīng)用人工氣候室設(shè)計(jì)出生產(chǎn)上可能出現(xiàn)的不同高溫水平（34℃、36℃、38℃、40℃），相對(duì)濕度均設(shè)置為70％。選取長(zhǎng)勢(shì)相近的棉花植株，每個(gè)品種選10株，每個(gè)溫度下2株，另外2株作為對(duì)照。在人工氣候箱達(dá)到預(yù)定溫度后，移入盆栽棉花樣本，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，進(jìn)行24h的高溫逆境脅迫處理，脅迫24h后取樣，同時(shí)對(duì)田間盆栽對(duì)照進(jìn)行取樣。每天保持盆中土壤含水量接近于田間持水量，定期澆水。肥料與化控運(yùn)籌按當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)栽培要求進(jìn)行。2010年研究了盛鈴期受高溫脅迫24h后對(duì)bt蛋白表達(dá)的影響；2011年在2010年基礎(chǔ)上又研究了盛鈴期高溫脅迫氮代謝的影響，以明確持續(xù)高溫對(duì)Bt蛋白表達(dá)和氮代謝的影響。供試土壤為沙壤土，含有機(jī)質(zhì)1．88％，水解氮134．7mg•kg－1，速效磷22．5mg•kg－1，速效鉀81．3mg•kg－1。實(shí)驗(yàn)所用盆缽直徑30cm，高27cm，每盆裝土11kg，在大田中取的土壤經(jīng)自然風(fēng)干、過(guò)篩去雜后裝盆，用水沉實(shí)。栽培方式為營(yíng)養(yǎng)缽育苗移栽，播種日期是4月7日，幼苗在5月19日（播種后41d）移栽到大田，5月20日（播種后42d）移栽于盆中。

1．2取樣方法于8月15日選取長(zhǎng)勢(shì)相近的棉花植株，對(duì)中部果枝1～2果節(jié)位，標(biāo)記當(dāng)日花，寫好日期，掛牌于相應(yīng)的果枝果節(jié)位，于花后10d進(jìn)行高溫脅迫處理，選取有相近果枝相同果節(jié)位的鈴的棉株，放入人工氣候室中進(jìn)行高溫逆境脅迫處理，每個(gè)品種選取10株，每個(gè)溫度下2株，另外2株作為對(duì)照，在24h的高溫逆境脅迫結(jié)束后，取事先標(biāo)記過(guò)的棉鈴，液氮速凍后放入超低溫冰箱中保存。

1．3測(cè)定項(xiàng)目與方法

1．3．1Bt蛋白含量測(cè)定。稱取一定量的鈴殼鮮樣，經(jīng)提取液研磨提取一段時(shí)間后，離心取上清液備用。用酶聯(lián)免疫法（Enzyme－linkedimmunosorbentassay，ELISA）進(jìn)行測(cè)定，藥盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。參見(jiàn)何鐘佩所編《農(nóng)作物化學(xué)控制實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》［4］。

1．3．2谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）含量測(cè)定。取樣后的蕾和鈴經(jīng)液氮速凍后，稱取的鮮樣經(jīng)Tris－HCl緩沖液研磨離心后，獲得的提取液采用賴氏比色法進(jìn)行測(cè)定［5］。

1．3．3游離氨基酸含量測(cè)定。將稱取的鮮樣研磨，過(guò)濾定容后，取提取液，應(yīng)用茚三酮比色法進(jìn)行測(cè)定［6］。

1．3．4葉片蛋白酶、肽酶活性、可溶性蛋白含量測(cè)定。參見(jiàn)文獻(xiàn)［7］。1．4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用Excel2003和SPSSV13．0進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2．1高溫脅迫對(duì)Bt棉鈴殼中殺蟲蛋白含量的影響圖1表明，盛鈴期常規(guī)種泗抗1號(hào)在34℃、36℃、38℃和40℃高溫水平脅迫24h條件下，10日鈴鈴殼中殺蟲蛋白的表達(dá)量與相應(yīng)對(duì)照（147．62ng•g－1）相比分別下降了3．75％，12．21％，33．43％和66．36％；雜交種泗抗3號(hào)的殺蟲蛋白的表達(dá)量則與相應(yīng)對(duì)照（153．55ng•g－1）相比分別下降了2．98％，10．71％，29．01％和57．93％。不同品種間相比，以常規(guī)種受高溫脅迫后下降幅度較大。圖1高溫對(duì)10日鈴鈴殼中殺蟲蛋白含量的影響

2．2高溫脅迫對(duì)Bt棉花鈴殼GPT活性的影響圖2表明，常規(guī)種泗抗1號(hào)盛鈴期在34℃、36℃、38℃和40℃高溫水平脅迫24h條件下，10日鈴鈴殼中谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶活性與相應(yīng)對(duì)照（11．93μmol•g－1•h－1）相比分別下降了7．05％，12．31％，35．7％和52．89％；雜交種泗抗3號(hào)的GPT活性則與相應(yīng)對(duì)照（13．72μmol•g－1•h－1）相比分別下降了5．62％，11．32％，34．27％和48．01％。圖2高溫對(duì)10日鈴鈴殼中的GPT活性的影響

2．3高溫脅迫對(duì)Bt棉花鈴殼氨基酸和可溶性蛋白含量的影響圖3表明，常規(guī)種泗抗1號(hào)、雜交種泗抗3號(hào)盛鈴期在34℃、36℃、38℃和40℃高溫水平脅迫24h條件下，10日鈴鈴殼中游離氨基酸含量比相應(yīng)對(duì)照有所增加，如泗抗3號(hào)的游離氨基酸的含量分別比對(duì)照增加了10．14％，26．29％，78．38％和129．28％。并且在36℃以上脅迫條件下，2個(gè)材料的游離氨基酸含量均顯著增加。圖3高溫對(duì)10日鈴鈴殼中的氨基酸含量的影響圖4表明SK－1、SK－3盛鈴期在34℃、36℃、38℃和40℃高溫水平脅迫24h條件后，10日鈴鈴殼中的可溶性蛋白含量與各自對(duì)照相比均呈不同程度下降，并隨著溫度的增加，下降幅度加大，如泗抗3號(hào)在4個(gè)溫度脅迫24h后，分別下降了2．90％，10．11％，24．8％和39．86％。

2．4高溫脅迫對(duì)Bt棉花鈴殼蛋白酶和肽酶活性的影響進(jìn)一步研究高溫脅迫下SK－1、SK－3棉鈴中蛋白酶與肽酶活性變化（圖5、圖6）表明，在34℃、36℃、38℃和40℃高溫水平脅迫24h后，2品種10日鈴鈴殼中蛋白酶、肽酶活性分別比各自對(duì)照有不同程度的增加，在36℃以上脅迫條件下，蛋白酶活性均顯著上升。不同品種間相比，以常規(guī)種SK－1上升幅度較大。

3討論

3．1高溫影響B(tài)t棉生殖器官殺蟲蛋白的含量已有研究表明，高溫影響B(tài)t棉的抗蟲性［8－9］。夏蘭芹等人研究認(rèn)為，溫度變化會(huì)影響抗蟲棉早期的生長(zhǎng)和Bt殺蟲基因的表達(dá)，從而影響B(tài)t基因的沉默發(fā)生時(shí)間［10］，但前人研究仍集中在葉片方面。本文通過(guò)研究不同高溫水平脅迫棉株24h對(duì)生殖器官抗蟲性的影響表明：高溫逆境條件盛鈴期棉鈴殺蟲蛋白表達(dá)量有明顯的下降，且隨著溫度水平的提高，下降的幅度也更大，并以在36℃以上時(shí)加劇下降。盛鈴期鈴殼中的殺蟲蛋白表達(dá)量在38℃、40℃時(shí)的下降幅度明顯高于36℃時(shí)的下降幅度，是它的2．7倍和5．4倍。推測(cè)36℃可能是棉花在高溫逆境條件下殺蟲蛋白含量表達(dá)的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，極有可能是棉花的高溫臨界點(diǎn)。因此，在大田生產(chǎn)中如果遇到持續(xù)超過(guò)該溫度的高溫，應(yīng)增加農(nóng)藥用量，增強(qiáng)棉株抗蟲能力。此外，殺蟲蛋白表達(dá)量在品種間以常規(guī)Bt棉品種泗抗1號(hào)的下降幅度較大，說(shuō)明盛鈴期高溫逆境會(huì)大幅度降低Bt蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而影響到棉花的抗蟲性。說(shuō)明雜交種的抗蟲性受高溫影響較小。

3．2高溫影響B(tài)t棉棉鈴抗蟲性，可能與高溫降低蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)蛋白質(zhì)分解密切相關(guān)已有研究表明，Bt棉體內(nèi)殺蟲蛋白表達(dá)量與氮代謝水平呈顯著以上水平正相關(guān)［11－13］。對(duì)高溫脅迫下鈴殼中氮代謝相關(guān)物質(zhì)和關(guān)鍵酶研究進(jìn)一步表明，鈴殼中殺蟲蛋白含量下降幅度大的，可溶性蛋白含量下降幅度也大，谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性下降幅度也大，游離氨基酸含量、蛋白酶和肽酶活性增加幅度也較大，品種間同樣表現(xiàn)為常規(guī)種的變化幅度較大。可見(jiàn)，高溫逆境條件會(huì)顯著降低蕾鈴中的Bt蛋白的表達(dá)量，這可能是因?yàn)楦邷啬婢硹l件易導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻，分解加快，這可能與高溫逆境降低蛋白質(zhì)的合成、促進(jìn)蛋白質(zhì)的分解密切相關(guān)。