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1材料與方法

1．1材料與試劑四棱豆，產(chǎn)自湖南懷化地區(qū)。復(fù)合蛋白酶，主要成分是堿性蛋白酶，酶活力≥120U/mg，上海楷洋生物技術(shù)有限公司。藥品:濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、甲醛、硼酸、硼砂、硫酸銅、硫酸鉀，以上試劑均為分析純。指示劑:甲基紅－溴甲酚綠混合指示劑、酚酞指示劑。

1．2主要儀器設(shè)備PK－S28型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;PGG－9070型電熱恒溫古風(fēng)電熱箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器郵箱公司;JJ－2組織搗碎勻漿機(jī)，上海浦東物理光學(xué)儀器廠;HJ－1型磁力加熱攪拌器，江蘇醫(yī)療儀器廠;PHS－25型數(shù)顯酸度計(jì)，杭州雷磁分析儀器廠;HSJ通風(fēng)柜，深圳市嘉鴻順實(shí)業(yè)有限公司;電爐，天津市泰斯特儀器有限公司;電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;分析天平，OHAUSCORPORATIONinSwiterland;SIEMENS冰箱，博西華家用電器有限公司。

1．3試驗(yàn)方法

1．3．1四棱豆蛋白質(zhì)溶液的制備稱取適量的四棱豆，用水浸泡24h后剝皮，按料水比1∶7的比例加入蒸餾水，用組織搗碎機(jī)打漿3min，然后用潔凈的紗布過濾，將所得四棱豆蛋白質(zhì)濾液在電爐上加熱30min，即自制的四棱豆蛋白質(zhì)溶液。待其冷卻后，測定其蛋白質(zhì)含量，并儲存在冰箱中備用。

1．3．2四棱豆蛋白質(zhì)溶液的酶解取適量的蛋白質(zhì)溶液，用2mol/L的NaOH和H2SO4溶液調(diào)節(jié)至試驗(yàn)設(shè)定的pH值，加入定量的復(fù)合蛋白酶，放入設(shè)制一定溫度的電熱恒溫水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，水解至預(yù)定時(shí)間后，將酶解液沸水浴鈍化蛋白酶5min。冷卻放置一段時(shí)間后再測定氨基態(tài)氮含量。

1．3．3水解度的測定方法粗蛋白含量的測定:采用GB/T15589．2—2008。氨基態(tài)氮測定:采用ZBX66038—87《氨基態(tài)氮測定法》。水解度的計(jì)算方法:水解度(DH)=(游離氨基氮/總氮)×100%。

1．3．4酶解條件的單因素試驗(yàn)(1)酶用量對酶解反應(yīng)的影響在pH值為6．0，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間為4h的酶解條件下，以水解度為指標(biāo)，設(shè)計(jì)酶用量為1%、2%、3%、4%、5%、6%，考察不同復(fù)合蛋白酶用量(以蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量為基準(zhǔn)，下同)對酶解反應(yīng)的影響。(2)酶解溫度對酶解反應(yīng)的影響在復(fù)合蛋白酶用量為5%，pH值6．0，酶解時(shí)間為4h的酶解條件下，設(shè)制溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，以水解度為指標(biāo)，考察不同溫度對酶解反應(yīng)的影響。(3)酶解時(shí)間對酶解反應(yīng)的影響在酶解溫度為50℃，pH值為6．0和復(fù)合蛋白酶用量為5%的酶解條件下，酶解時(shí)間為1h、2h、3h、4h、5h、6h，以水解度為指標(biāo)，考察不同時(shí)間對酶解反應(yīng)的影響。(4)pH值對酶解反應(yīng)的影響在酶解時(shí)間為5h、酶解溫度為50℃、復(fù)合蛋白酶用量為5%的酶解條件下，設(shè)計(jì)pH值為4、5、6、7、8、9，以水解度為指標(biāo)，考察不同pH值對酶解反應(yīng)的影響。

1．3．5復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)為了確定復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)的最佳條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)。選擇酶解溫度、pH、復(fù)合蛋白酶用量和酶解時(shí)間作為正交試驗(yàn)的4個(gè)因素，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，因素水平表見表1。

1．3．6復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)的最佳條件驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)上述4因素3水平正交試驗(yàn)，驗(yàn)證復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)的最佳條件是否正確。

2結(jié)果與分析

2．1四棱豆乳濁液中蛋白質(zhì)的含量將四棱豆去皮以料水比1∶7打成漿過濾，重復(fù)3次取樣測定此時(shí)乳濁液的蛋白質(zhì)含量。由表2可知四棱豆在以料水比為1∶7的情況下，四棱豆乳濁液的蛋白質(zhì)含量為2．89%。

2．2復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白的單因素試驗(yàn)

2．2．1酶用量對酶解反應(yīng)的影響用復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)溶液時(shí)，酶用量對酶解反應(yīng)有很大影響。酶用量對酶解反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，當(dāng)復(fù)合蛋白酶用量小于5%時(shí)，四棱豆蛋白質(zhì)溶液的水解度隨著復(fù)合蛋白酶用量的增加迅速增大;當(dāng)復(fù)合蛋白酶用量大于5%時(shí)，四棱豆蛋白質(zhì)溶液的水解度隨著酶用量的增加并沒有顯著增大。這是由于酶量增加，酶與底物作用得更充分，提高了酶對不溶性蛋白的作用能力，隨著酶量的繼續(xù)增加，酶與底物的作用達(dá)到飽和，反應(yīng)達(dá)到最大，即使再增加酶量，四棱豆蛋白質(zhì)溶液的水解度變化也不會明顯。因此，考慮到經(jīng)濟(jì)成本以及對資源的有效利用，復(fù)合蛋白酶用量為5%時(shí)，酶解反應(yīng)效果最為理想。

2．2．2酶解溫度對酶解反應(yīng)的影響酶解溫度對復(fù)合蛋白酶活性的影響很大。隨著溫度的升高，酶催化反應(yīng)速度加快，至達(dá)到最大反應(yīng)速率為止，高溫時(shí)酶反應(yīng)速度減小，這是酶本身由于高溫變性所致。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，當(dāng)溫度為50℃時(shí)，四棱豆蛋白質(zhì)溶液的水解度達(dá)到最高值。當(dāng)?shù)陀?0℃時(shí)，隨著溫度的提高，蛋白酶的酶活增加，酶對底物的作用效果增強(qiáng)，四棱豆蛋白質(zhì)溶液的水解度隨之增加;當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，酶活性逐漸降低，四棱豆蛋白質(zhì)溶液的水解度降低，同時(shí)過高的溫度會使酶的活性中心結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致酶變性，部分或全部失去催化活性，因此初步確定最適酶解溫度為50℃。

2．2．3酶解時(shí)間對酶解反應(yīng)的影響酶解時(shí)間也是影響復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)溶液的重要影響因素之一。合適的酶解時(shí)間能夠有效地提高生產(chǎn)效率，節(jié)省成本。試驗(yàn)結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間小于5h時(shí)，四棱豆蛋白質(zhì)溶液的水解度隨著時(shí)間的增加逐漸增大;當(dāng)酶解時(shí)間大于5h時(shí)，四棱豆蛋白質(zhì)溶液的水解度隨著時(shí)間的延長變化不大。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，底物不斷減少，酶解充分［13］，因此最適提取時(shí)間為5h。

2．2．4pH值對酶解反應(yīng)的影響同溫度一樣，pH值對復(fù)合蛋白酶的活性影響也很大。過酸過堿都會影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至?xí)姑缸冃允Щ睢．?dāng)pH值變化不是很劇烈時(shí)，酶雖未變性，但活力會受到影響，從而抑制或促進(jìn)酶解反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，pH值對水解度的影響較大。當(dāng)pH值小于或大于7．0時(shí)，復(fù)合蛋白酶的活性受到抑制，致使水解度降低。在pH值為7．0時(shí)，四棱豆蛋白質(zhì)溶液的水解度達(dá)到最大值。因此，復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)時(shí)，調(diào)節(jié)pH值為7．0左右時(shí)，效果最佳。

2．3復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)最佳水解條件優(yōu)化本試驗(yàn)選擇酶解溫度、pH、復(fù)合蛋白酶用量和酶解時(shí)間作為正交試驗(yàn)的4個(gè)因素，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，酶解試驗(yàn)中影響四棱豆水解效果的主次因素為:D＞C＞B＞A，說明在用復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)的酶解條件中，因素D即酶解時(shí)間為最重要因素;其次分別是因素C和因素B，即復(fù)合蛋白酶用量和酶解時(shí)的pH值;因素A即酶解溫度為不重要因素。復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)的最佳酶解優(yōu)化工藝參數(shù)為A1B2C2D2，即:酶解溫度為45℃，pH值為7．0，復(fù)合蛋白酶用量為5%，酶解時(shí)間為5h。

2．4復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)最佳水解條件驗(yàn)證結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明:在復(fù)合蛋白酶用量為5%、酶解溫度45℃、pH值7．0、酶解時(shí)間5h的水解條件下，用復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)溶液獲得的酶解液的水解度最高，達(dá)到18．59%。故試驗(yàn)得出的復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)的最佳水解條件具有可重復(fù)性。

3結(jié)論

通過在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，確定了復(fù)合蛋白酶水解四棱豆蛋白質(zhì)的最佳酶解優(yōu)化工藝參數(shù)為酶解溫度為45℃、pH值為7．0、復(fù)合蛋白酶用量為5%、酶解時(shí)間為5h，水解度可以達(dá)到18．59%。

作者：廖盧艷蔣立文單位：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院