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摘要:為了提高小鵝瘟病毒pcr檢測的檢出率，試驗根據(jù)現(xiàn)有的小鵝瘟病毒基因序列，設計合成了1對特異性引物，以實驗室中保存的小鵝瘟病料DNA為模板，對反應程序中的延伸時間、退火溫度等循環(huán)參數(shù)進行優(yōu)化，并進行了敏感性和特異性檢測。結(jié)果表明:優(yōu)化后的延伸時間為45s，退火溫度為48.0℃;優(yōu)化后的方法對小鵝瘟病毒可擴增出大小為550bp的特異性條帶，對照毒株擴增結(jié)果均為陰性，其靈敏度為146.00pg/μL。說明優(yōu)化后的PCR方法特異性強、敏感性高，反應時間明顯縮短。

關(guān)鍵詞:小鵝瘟;PCR;條件優(yōu)化;DNA病毒;敏感性

小鵝瘟(goslingplague，GP)是由細小病毒科、細小病毒屬中的鵝細小病毒(Gooseparvoviruse，GPV)引起的一種雛鵝急性或亞急性的敗血性傳染病。該病主要發(fā)生于2周齡以內(nèi)的雛鵝，具有發(fā)病率高、致死率高和傳播速度快等特點。朱堃熹等［1］對40例典型病例進行了系統(tǒng)的病理解剖學研究，結(jié)果顯示，該病的主要病變?yōu)榧毙钥ㄋ裕w維素性壞死性小腸炎，可引起小腸梗阻。自1962年方定一［2］及其研究團隊首次發(fā)現(xiàn)此病以來，多家研究單位研究和建立了GPV的PCR快速檢測方法［3－6］，但其條件未能達到最佳，趙磊等［7］對GPVDNA的提取方法進行了優(yōu)化，確定以微量法提取GPV核酸最具優(yōu)勢。本試驗對GPVPCR檢測的延伸時間、退火溫度等循環(huán)參數(shù)進行了優(yōu)化，并檢測了特異性和敏感性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1材料與方法

1.1病毒Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒(DHAV－Ⅰ)、Ⅲ型鴨病毒性肝炎病毒(DHAV－Ⅲ)、鴨瘟病毒(Duckplaguevirus，DPV)、GPV、鴨圓環(huán)病毒(Duckcircovirus，DuCV)、番鴨細小病毒((Muscovyduckparvoviru，MDPV)、鴨副黏病毒(Duckparamyxoviru，DPMV)、新型鴨肝炎病毒(NCHV)，均由西南大學動物科學學院動物疾病快速診斷中心保存。

1.2主要試劑及儀器DNA提取試劑盒、rTaqDNA聚合酶、DL－2000Marker、TEBuffer，均購自寶生物工程(大連)有限公司;BiodropuLITE分光光度計，由西南大學動物科學學院動物疾病快速診斷中心提供。

1.3引物根據(jù)GPV的基因序列，應用PrimerPremier5.0軟件設計1對寡聚核苷酸引物，序列為上游引物5'－CCAAGCTACAACAACCACATCTAC－3'和下游引物5'－CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC－3'，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4病毒DNA的提取取西南大學動物科學學院動物疾病快速診斷中心保存的GPV，參照DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA。

1.5PCR檢測方法的建立與優(yōu)化反應體系:GPVDNA模板3μL，rTaqDNA聚合酶12.5μL，上、下引物各1μL，用7.5μLddH2O補至25μL。對反應程序中的延伸時間、退火溫度等循環(huán)參數(shù)進行優(yōu)化，確定最佳反應程序。設定延伸時間分別為15，30，45，60，75，90s;退火溫度分別為38.0，39.8，44.3，47.2，48.0，54.5，61.5，65.0℃。

1.6PCR敏感性檢測用BiodropuLITE分光光度計在OD260/OD280值下測得DNA原濃度為934.37ng/μL，用TEBuffer對原濃度DNA進行10倍梯度稀釋至93.437pg/μL，再對濃度為934.37×10－2ng/μL的DNA進行2倍梯度稀釋，分別測定每次稀釋后的DNA濃度，并各取3μL加到反應體系中進行敏感性檢測。

1.7PCR特異性檢測用優(yōu)化后的最佳反應程序?qū)HAV－Ⅰ、DHAV－Ⅲ、DPV、GPV、DuCV、MDPV、DPMV、NCHV的DNA或cDNA進行PCR擴增。

2結(jié)果與分析

2.1PCR檢測方法的建立與優(yōu)化對反應程序中的延伸時間、退火溫度等循環(huán)參數(shù)進行優(yōu)化，確定最佳反應程序。

2.1.1延伸時間的篩選保持其他條件不變，設定延伸時間分別15，30，45，60，75，90s進行PCR擴增，結(jié)果延伸時間為45s時擴增得到的條帶最亮。

2.1.2退火溫度的篩選保持其他條件不變，設定退火溫度梯度為38.0～65.0℃進行PCR擴增，結(jié)果退火溫度為48.0℃時擴增得到的條帶最亮。

2.1.3PCR擴增根據(jù)2.1.1和2.1.2的篩選結(jié)果確定最佳的反應程序為:95℃預變性5min;95℃變性1min，48.0℃退火1min，72℃延伸45s，共30個循環(huán);72℃再延伸5min，12℃保存。

2.2PCR敏感性檢測

結(jié)果顯示，采用10倍稀釋和2倍稀釋的方法可在146.00pg/μL～934.37ng/μL范圍內(nèi)擴增出清晰的條帶，濃度為93.437pg/μL時未擴增出條帶。說明優(yōu)化后的PCR方法檢測GPV的靈敏度為146.00pg/μL。2.3PCR特異性檢測結(jié)果顯示，優(yōu)化后的PCR方法能檢測到標準陽性GPV毒株，而對DHAV－Ⅰ、DHAV－Ⅲ、DPV、DuCV、MDPV、DPMV、NCHV均檢測不到特異性條帶。

3討論

小鵝瘟是導致雛鵝死亡的常見疾病之一，可造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重危害養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。目前，對GPV的檢測技術(shù)主要有瓊脂擴散試驗［8－9］、酶聯(lián)免疫吸附試驗［10］、免疫酶斑點法［11］、免疫熒光試驗［12］和PCR檢測方法等。隨著分子生物學診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR快速檢測方法省時省力，得到了認可并成為最常用的檢測方式。本試驗利用保存于實驗室的GPV，對已有的小鵝瘟PCR檢測條件進行優(yōu)化，篩選出反應時間最短、反應效率最高的一組條件，特異性

作者：童艷梅；李嫻妍；陳義旺；馬曉強；顧江風；楊夢琪；劉雨；楊曉偉；趙光偉 單位：西南大學動物科學學院動物醫(yī)學系