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《供水技術雜志》2016年第5期

摘要:

氯霉素藥物在水產及畜牧業使用廣泛，相關的行業用水及抗生素生產廢水會在水域中殘留，若被人體長期攝取，會造成被動的抗生素濫用，嚴重影響民眾身體健康水平，因此水中氯霉素的檢測需要引起重視。開發了一種針對水樣品中氯霉素的快速檢測方法。通過比較確定氮吹法為最優的前處理方法，并得到了較高的檢測靈敏度(25ng/L)。本研究為ELISA法在水質檢測中的應用提供了一個范例，給水源污染應急檢測提供一個快速檢測方案。

關鍵詞:

酶聯免疫法;氯霉素;凍干;氮吹

酶聯免疫法自1971年建立以來，由于其極高的靈敏度、特異性及適用性，已成為生物及分析化學領域的前沿課題［1］。目前此法在醫學、檢測食品藥物殘留方面有廣泛成熟的應用，而在水質檢測中報導較少。形成這種情況的重要原因之一是ELISA研發過程中的樣品處理方式不適用于水質樣本檢測。氯霉素屬廣譜類抗生素藥物，能抑制尤其是革蘭氏陰性菌細菌蛋白質的合成，對各種立克氏體、原蟲及部分病毒也有一定的抑制作用［2］。目前氯霉素類藥物在水產和畜禽養殖中仍應用廣泛，添加氯霉素的水產養殖水和抗生素制藥廠偷排的廢水是環境中氯霉素的來源。因此氯霉素的環境污染，尤其是水域中的污染是值得重視的問題［3］。目前檢測氯霉素方法包括高效液相色譜法［4－5］、氣相色譜法［6］、質譜法［7－9］等，其分析時間長、樣品前處理復雜、需要昂貴的儀器且對操作人員技能有很高的要求。本文將探索酶聯免疫法如何與適合的樣品前處理技術結合，以氯霉素(Chloramphenicol)為目標物，測定水中的氯霉素含量。而ELISA方法不但有極高的特異性、準確度和靈敏度，還具有檢測速度快、同時檢測大量樣本、方便易用的特點。

1材料與方法

1.1試劑和儀器

試劑:氯霉素標準溶液100μg/mL(甲醇溶劑，國家標準物質中心)、乙腈(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)、甲醇(色譜純)，Milli－P超純水，氯霉素檢測試劑盒(深圳市易瑞生物技術有限公司)。儀器:ThermoMultiskanFC96孔酶標儀(配備450和630nm濾光片);Eppendorf5702離心機(轉速4000r/min);DenverInstrument天平(感量0．00001g);IKAMS3basic渦旋儀;氮氣吹干儀;Thermofinnpippete移液器:單道10～100μL、100～1000μL、多道30～300μL。

1.2試驗方法

1.2.1準備

使用試劑盒前將試劑和微孔板回溫至室溫，用后放回2～8℃。取出需要數量的微孔板，其余的放入自封袋中，保存于2～8℃。建議每個樣品和標準液做2次平行試驗。

1.2.2加樣

加入標準品/樣品50μL到相應微孔，然后加入酶結合物50μL到每個微孔，最后加入抗體工作液50μL到每孔，輕輕震蕩混勻后，蓋上蓋板膜。

1.2.3孵育

室溫25℃下避光反應30min。

1.2.4洗板

小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加1×洗滌液250μL/孔，重復洗滌5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。

1.2.5顯色

每孔依次加入底物液A50μL，底物液B50μL，輕輕震蕩混勻后，蓋上蓋板膜，25℃室溫下避光反應15min。

1.2.6終止和讀值

加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處(用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據)，測定每孔OD值。

1.2.7樣品處理方法

取1mL水樣于1．5mL離心管中;采樣不同的富集方式進行濃縮;加入樣本復溶液0．2mL，渦旋震蕩5min后用于點樣(樣本稀釋倍數為0．2倍)。

1.3計算方法

標準品和樣品的平均吸光度值(平均OD值)除以零標準的平均吸光度值(平均OD值)，再乘以100。零標準為100%(最大吸光度值)，其他OD值為最大吸光度的百分數。吸光度值%=BB0×100%式中B———標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0———0ppb標準溶液的平均吸光度值校準曲線以log(標準品濃度)為橫坐標，以Logit(B/B0)為縱坐標，構建線性回歸方程。將樣品的Logit(B/B0)值代入上述回歸方程，求得的值乘以樣本稀釋倍數0．2，即為樣本中氯霉素含量。

2結果與分析

2.1水中氯霉素的富集

2.1.1富集方式的選擇

水中痕量抗生素富集方法可以用凍干法或氮吹濃縮富集法。凍干法是取1mL水樣品，冷凍成冰干燥過夜后再測定。選取了新鮮制備的雙蒸水作為陰性樣本。通過在1mL陰性樣本中添加不同量的氯霉素，對兩種方法進行回收率對比實驗，結果見表1。對比試驗表明凍干法回收率略高于氮吹法。凍干法可很好地實現水溶液中氯霉素的富集，但操作時間過長(16h以上)，且需要配備凍干機。氮吹濃縮時間較短，試驗回收率也能滿足回收率＞70%的檢測要求。本次選用氮吹濃縮進行水中氯霉素的富集。

2.1.2富集用有機溶劑的選擇

因水相對常用有機溶劑來說沸點較高，不易吹干，需通過往水中摻和有機溶劑形成低沸混合物的方法來有效降低水的沸點，從而提高氮吹濃縮時效。根據氯霉素的溶解性、有機溶劑與水的互溶性、共沸物形成情況等因素，選定乙腈作為水中氯霉素濃縮富集的有機溶劑。

2.1.3富集用有機溶劑與水比例的選擇

1mL水樣品中添加不同含量乙腈對濃縮干燥時間有一定影響。在78℃加熱，1mL水樣品中添加1，3，5，7，9和11mL的乙腈，干燥時間如下表2所示。隨乙腈加量增加，干燥時間先降后升。當乙腈:水比例為9∶1時，所需時間最短，此時最接近乙腈－水共沸物(乙腈含量85%，共沸點76℃)［10］。故選用乙腈∶水(9∶1)作為富集用低沸混合溶劑。不同乙腈摻和量的樣品干燥時間如表2所示。

2.2試劑盒有效性復核

2.2.1線性檢測

配置0，25，100，400和1600ng/L的5點標準點，繪制標準曲線，標準曲線的R2值為0．993，線性較好，符合檢測要求。氯霉素ELISA的標準曲線如圖1所示。

2.2.2檢出限

以超純水為空白樣品，測定6個空白樣品的平均值，再加上3倍標準差，即為檢測限。配置0，25，100，400，1600ng/L的5點標準曲線(R2=0．993)，計算由上表可知檢測限為24．81ng/L，與試劑盒檢出限標識相符。

2.3實際樣品測試

選取了具有代表性的5個出廠水和6個管網水點位的樣本進行了實際樣品檢測。5個出廠水，分別編號為:CC1，CC2，CC3，CC4，CC5;6個管網水，分別編號為GW1，GW2，GW3，GW4，GW5，GW6。平行測試3次，取平均值，測定結果如表4所示。

3結論

①通過優化選擇，獲得了水質樣本ELISA檢測前處理的合適方法。將進一步提高ELISA檢測在水環境檢測中的應用前景。

②氮吹－ELISA法的建立應用，大大提高了檢測時效，適合水質樣品的快速篩查定量。該方法對控制水質安全，應對突發性安全事件等水質監控具有重要意義。

參考文獻:

［2］周正紅，鄧斌，林保銀．氯霉素類抗生素殘留分析研究進展［J］．肉類研究，2006，2(1)，34－38．

［3］韓敏奇，蔣增輝，陸志惠，等．酶聯免疫法測定上海原水中四環素濃度［J］．供水技術，2015，9(6):57－59．

［4］彭莉，岳秀英．高效液相色譜法測定牛奶中的氯霉素殘留［J］．中國獸醫藥志，2002，36(8):23－24，22．

［5］李蘭生，王勇強．氯霉素在對蝦全內的動力學研究［J］．色譜，1997，15(5):431．

［6］王太全，錢成，徐成，等．氣相色譜法測定出品龍蝦中氯霉素殘留量的研究［J］．肉品衛生，2003，9(1):11－14．

［7］孫亮，陳海東．GC－MS/MS測定蝦仁中氯霉素的研究［J］．中國衛生檢驗雜志，2003，13(3):293－294．

［8］張輝．離子阱時間串聯質譜測定食品中的氯霉素［J］．浙江科技學院學報，2003，15(11):46－47．

［9］楊成對，宋莉暉，毛麗哈，等．對蝦中氯霉素殘留的分析方法研究［J］．分析化學研究簡報，2004，32(7):905－907．

［10］穆光照．實用溶劑手冊［M］．上海:上海科技出版社，1990．

作者:劉靜 董煜杰 嚴義勇 單位:成都市自來水有限責任公司水質中心 深圳市易瑞生物技術有限公司