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工程化改造方法往往先考慮宿主的篩選和啟動子/信號肽的優(yōu)化，通過改造一般會使蛋白質(zhì)分泌水平提高3～10倍。然而即使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯水平以及宿主均達(dá)到最優(yōu)水平時，許多蛋白質(zhì)的表達(dá)量仍然相對較低，這表明外源蛋白分泌不僅僅是一個蛋白質(zhì)合成的過程，還涉及很多復(fù)雜的調(diào)控過程，涉及初生蛋白的共轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊及監(jiān)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體內(nèi)的翻譯后糖基化修飾、胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和分選及蛋白酶降解等過程，因此通過遺傳修飾對宿主菌的工程化改造成為提高蛋白質(zhì)表達(dá)量的最有效的手段。隨著后基因組技術(shù)的發(fā)展和系統(tǒng)生物學(xué)方法的應(yīng)用，菌株工程化改造研究得到了極大的發(fā)展［6］。本文主要從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊及監(jiān)控過程和胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸途徑的角度綜述酵母分泌系統(tǒng)工程化改造的研究進(jìn)展。

1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白折疊及監(jiān)控過程的工程化改造

1．1蛋白質(zhì)胞內(nèi)分泌過程

蛋白質(zhì)的胞內(nèi)分泌過程起始于通過SEC61易位子向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)運(yùn)過程，進(jìn)而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)折疊形成天然結(jié)構(gòu)，此過程受到嚴(yán)格的監(jiān)視調(diào)控［7～10］。初生蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，與kar2基因編碼的分子伴侶結(jié)合蛋白BiP相結(jié)合折疊成天然結(jié)構(gòu)，同時與cnei基因編碼的鈣連接蛋白結(jié)合輔助其正確折疊并進(jìn)行N-糖基化加工，此外在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)還可進(jìn)行一系列共價修飾，包括信號肽加工、二硫鍵形成、N-糖基化、蛋白降解及分選等。經(jīng)折疊及修飾加工后，只有正確折疊組裝的蛋白可以從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)入高爾基體，在高爾基體中經(jīng)進(jìn)一步修飾加工后被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外、液泡或其他細(xì)胞器，而發(fā)生錯誤折疊或形成多聚體的蛋白質(zhì)則會被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)監(jiān)控系統(tǒng)識別，并與BiP復(fù)合物結(jié)合進(jìn)而進(jìn)入胞質(zhì)中被降解，此過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解(ERAD)［11］。一部分錯誤折疊的蛋白質(zhì)與BiP的結(jié)合更為持久，會誘發(fā)非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)［12］，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)水解過程，并抑制蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

1．2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊監(jiān)控體系構(gòu)成

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白質(zhì)折疊和監(jiān)控體系主要包括五類要素:輔助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶(如BiP、鈣連蛋白和鈣網(wǎng)蛋白等)、輔助蛋白質(zhì)形成正確構(gòu)象的酶(如二硫鍵異構(gòu)酶PDI)、ERAD相關(guān)蛋白降解機(jī)制、UPR相關(guān)信號通路和參與翻譯后修飾的酶。

1．3工程化改造

由于存在復(fù)雜嚴(yán)格的監(jiān)控體系，蛋白質(zhì)折疊往往成為外源蛋白分泌最主要的限速瓶頸，而折疊和監(jiān)控體系也成為菌株工程化改造的主要對象。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊和監(jiān)控系統(tǒng)的復(fù)雜性和嚴(yán)格性與很多基因相關(guān)，對其進(jìn)行遺傳修飾比較困難。因此一種更為直接有效的方法是過表達(dá)多種分子伴侶、二硫鍵異構(gòu)酶及其他輔助折疊因子。已有研究表明，過表達(dá)一種Hsp70家族的分子伴侶BiP可以促進(jìn)外源蛋白在釀酒酵母中的分泌，人紅細(xì)胞生成素的表達(dá)量可提高5倍［13］，牛凝乳酶的表達(dá)理論上可提高26倍［14］;而降低BiP的水平會導(dǎo)致外源蛋白分泌水平下降［15］。但分子伴侶對蛋白質(zhì)分泌的影響并非適用于所有情況，具有蛋白質(zhì)或宿主特異性，有些研究也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)分子伴侶對蛋白質(zhì)的分泌有負(fù)面的影響。如多形漢遜酵母過表達(dá)BiP使黑曲霉葡萄糖氧化酶的胞外表達(dá)水平降低了10倍［16］，可能的解釋是，由于分子伴侶系統(tǒng)存在級聯(lián)效應(yīng)，Bip過表達(dá)可能會阻抑其他分子伴侶的作用，另外過表達(dá)也會增加其與靶蛋白持久結(jié)合的可能性，從而促進(jìn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)水解過程而非蛋白分泌過程。其他一些輔助因子也對蛋白分泌具有調(diào)控作用。共伴侶分子DNAJ及其他因子(如SLS1/SIL1和LHS1)可以調(diào)控BiP的ATP酶活性，影響其參與的多種功能，包括易位子門控、初生蛋白折疊、錯誤折疊蛋白靶向降解、非折疊蛋白反應(yīng)調(diào)控和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存等。在釀酒酵母中，過表達(dá)單一或多種共伴侶分子，如JEM1(一種DNAJ同源蛋白)、SIL1、LHS1和SCJ1，可以顯著提高重組人白蛋白rHA、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白rTf及GM-CSF的表達(dá)量［17］。二硫鍵異構(gòu)酶PDI和巰基氧化酶等對于蛋二硫鍵的形成具有重要作用，過表達(dá)PDI可以提高某些蛋白的分泌水平［18］，同時過表達(dá)PDI和分子伴侶蛋白對于轉(zhuǎn)鐵蛋白的分泌表達(dá)提高具有協(xié)同效應(yīng)［19］。在粟酒裂殖酵母中，提高兩種PDI的水平可以顯著提高轉(zhuǎn)鐵蛋白的分泌水平［20］，增加PDI和聚泛素蛋白基因水平也可以極大提高人血白蛋白的表達(dá)水平，但對IL-1β的表達(dá)沒有影響［21］。另一種促進(jìn)分泌的方法是調(diào)節(jié)UPR信號通路調(diào)節(jié)蛋白Hac1。非折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生累積，通過HAC1誘發(fā)非折疊蛋白反應(yīng)，從而激活分子伴侶表達(dá)并抑制目的蛋白的分泌。釀酒酵母過表達(dá)里氏木霉hac1基因時，芽胞桿菌α-淀粉酶的分泌量提高了2．4倍［22］;釀酒酵母hac1基因過表達(dá)可使內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶分泌量提高2倍，重組α-淀粉酶產(chǎn)量提高70%［22］;過表達(dá)hac1選擇性剪接形式(hac1i)可以提高3種重組蛋白的分泌［17］。然而令人意外的是，過表達(dá)共分子伴侶(sil1，lhs1，jem1和scj1)反而會使hac1i轉(zhuǎn)錄水平降低2倍，hac1表達(dá)的破壞會使α-淀粉酶和內(nèi)切葡聚糖酶EGI的分泌分別減少75%和50%，但對內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶分泌量沒有影響［22］。這些結(jié)果表明，hac1過表達(dá)對分泌的影響具有蛋白質(zhì)或宿主特異性，而且HAC1蛋白與其他分子伴侶之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。

2胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸通路的工程化改造

2．1蛋白質(zhì)胞內(nèi)運(yùn)輸過程

蛋白質(zhì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程包括初始共翻譯、翻譯后轉(zhuǎn)位入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔，以及隨后逐步膜泡運(yùn)輸過程(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體、高爾基體內(nèi)部、后高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn))。蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊后主要通過包膜運(yùn)輸小泡進(jìn)行選擇性運(yùn)輸，因此胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸一般稱為膜泡運(yùn)輸或膜運(yùn)輸。新合成的蛋白質(zhì)往往被有選擇地濃縮到不同的膜泡群體中，進(jìn)而靶向不同的受體，稱為蛋白靶向或蛋白質(zhì)分選。分泌運(yùn)輸早期從胞質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)是蛋白質(zhì)運(yùn)輸通路中不可忽視的重要環(huán)節(jié)。在酵母中，存在兩條由胞質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的靶向轉(zhuǎn)運(yùn)途徑:共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。信號肽對于蛋白質(zhì)的靶向轉(zhuǎn)運(yùn)是必須的，其由一段長度為15～50個氨基酸的片段組成，通常有一個疏水核心、一段帶正電的N端及一段親水的C端。在共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中，一旦信號肽N端暴露出來，核糖體－新生蛋白鏈復(fù)合物會通過信號識別顆粒(SRP)和其受體(SR)被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的易位子通道;而酵母分泌蛋白主要選擇翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，這是由于這些蛋白質(zhì)的信號肽疏水性不強(qiáng)，合成時逃脫了SRP的識別，這些蛋白質(zhì)從核糖體上釋放出來后被胞質(zhì)分子伴侶及共伴侶識別，以維持其非折疊或松散折疊的狀態(tài)，直到通過易位子通道，這意味著過表達(dá)胞質(zhì)分子伴侶和核糖體結(jié)合因子可能會對蛋白質(zhì)分泌有一定的作用。

2．2工程化改造

2．2．1信號肽優(yōu)化早期分泌過程中，蛋白質(zhì)靶向的特異性主要由分泌信號肽的疏水核心及其與胞質(zhì)內(nèi)SRP的相互作用所決定，因此對應(yīng)每一種宿主系統(tǒng)都開發(fā)了多種類型的N端分泌信號肽和酵母特異的前導(dǎo)氨基酸序列，信號肽剪切位點(diǎn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中被一步一步加工處理，以確保目的蛋白從胞質(zhì)經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的正確轉(zhuǎn)運(yùn)。源于酵母信號肽的應(yīng)用可以提高外源蛋白的分泌水平。源于釀酒酵母的前導(dǎo)信號肽α因子包含一個連續(xù)兩個堿性氨基酸位點(diǎn)，此位點(diǎn)可以被高爾基體中的內(nèi)切蛋白酶識別，應(yīng)用此信號肽可以獲得對外源蛋白的高效分泌表達(dá)。釀酒酵母信號肽MFα可以提高纖維素酶Eg1和血管內(nèi)皮生長因子在酵母中的分泌水平［23，24］。在釀酒酵母和畢赤酵母中，應(yīng)用綠色熒光蛋白和其他異源蛋白作為報道蛋白對不同的信號肽序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，α因子更適用于外源蛋白的分泌表達(dá)［25，26］。Liang等［27］通過分析酵母內(nèi)源性蛋白的信號肽，發(fā)現(xiàn)了3種可能的分泌信號序列，這些信號序列與α因子一樣，可以促使綠色熒光蛋白和其他異源蛋白有效的分泌。其他來源的信號肽有些也適用于酵母系統(tǒng)，例如應(yīng)用里氏木霉自身疏水蛋白HFBI和HFBII序列作為分泌信號可以獲得較高水平綠色熒光蛋白的分泌［28］。對某些無法有效進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)，優(yōu)化信號肽序列是最有效的提高分泌水平的方法。然而有些時候信號肽的優(yōu)化也無法有效地引導(dǎo)靶蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，研究表明除N端信號肽外，信號錨定序列的性質(zhì)也對蛋白質(zhì)的運(yùn)輸方式具有決定作用，因此將目的蛋白與某些其他蛋白、亞結(jié)構(gòu)域、標(biāo)簽蛋白或信號錨定肽進(jìn)行融合表達(dá)也有利于蛋白質(zhì)分泌。

2．2．2運(yùn)輸通路改造胞內(nèi)運(yùn)輸每個步驟中膜泡的正確靶向都受許多胞內(nèi)膜蛋白的控制，并決定最終的整體分泌水平，因此當(dāng)存在運(yùn)輸效率低或分選錯誤的情況時，對于運(yùn)輸通路的遺傳優(yōu)化是最先考慮的改造方式。有些情況下，盡管蛋白質(zhì)已經(jīng)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并進(jìn)行正確折疊后也無法從胞內(nèi)分泌出來，這表明在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體或后高爾基體運(yùn)輸過程中還存在其他的限制因素。這兩個過程涉及大量膜蛋白，其中一部分功能還不明確，因此明確蛋白在胞內(nèi)運(yùn)輸過程中的限制環(huán)節(jié)是工程化改造的首要步驟。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)人生長激素在裂殖酵母中進(jìn)行表達(dá)時，有部分激素蛋白滯留于胞內(nèi)，這主要由從高爾基體到液泡的錯誤分選造成。液泡蛋白分選受體VPS10在這一分選過程中起主要作用，VPS10也是液泡羧肽酶CPY的受體，所以其介導(dǎo)的液泡分選途徑也被稱為CPY途徑。在晚高爾基體中，液泡定位的各種酶主要通過結(jié)合Vps10從而與分泌蛋白分離，這表明存在VPS10介導(dǎo)的錯誤分選使分泌蛋白積累于液泡中的可能。在酵母中也有類似的報道，vps10基因缺失對于某些外源蛋白的分泌有正面影響［29］，而對于胰島素融合蛋白沒有效果，而缺失其他五種vps基因(vps4、vps8、vps13、vps35和vps36)卻可以提高其分泌水平。這表明除VPS10途徑外還存在其他的液泡分選途徑，如需要接頭蛋白AP3和VPS41參與的堿性磷酸酶(ALP)途徑等，可見液泡分選途徑也具有蛋白質(zhì)特異性，對其進(jìn)行遺傳修飾還需要對相關(guān)基因功能有進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。盡管運(yùn)輸過程進(jìn)行遺傳修飾已經(jīng)成為一種可能的宿主工程化方式，但目前還難以通過修飾一個或少數(shù)幾個基因來達(dá)到對蛋白運(yùn)輸?shù)耐耆刂疲疫@種修飾常會影響細(xì)胞的活性。

2．2．3融合表達(dá)對于某些難以進(jìn)入分泌途徑的融合蛋白，往往可以通過融合標(biāo)簽或其他促分泌蛋白來進(jìn)行改善。Ahn等［30］報道通過在N端融合一段來自于哈茨木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ的細(xì)胞膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，可以使嗜熱脂肪芽胞桿菌脂肪酶L1在釀酒酵母中的分泌量提高7倍，在高密度發(fā)酵條件下分泌表達(dá)水平達(dá)到1．3g/L;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在CBD和L1之間插入一個Kex2酶切位點(diǎn)仍然表現(xiàn)出相同的提高水平，由于此酶切位點(diǎn)在高爾基體中被識別剪切，因此推測CBD結(jié)構(gòu)域主要在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中起作用。此外在釀酒酵母中融合表達(dá)類芽胞桿菌纖維素酶和細(xì)胞壁蛋白Pir4的不同結(jié)構(gòu)域，也實(shí)現(xiàn)了該蛋白在釀酒酵母中的成功表達(dá)［31］。因此當(dāng)菌株或靶蛋白改造難以起效時，融合表達(dá)也是一種有效的改善蛋白質(zhì)分泌水平的手段。

3展望

在已經(jīng)發(fā)展成熟的酵母表達(dá)載體和發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，對蛋白質(zhì)分泌途徑的系統(tǒng)化修飾已經(jīng)成為一種常用的酵母分泌體系改造策略。基因組技術(shù)的快速發(fā)展將會為酵母體系的進(jìn)一步改造提供新的更為系統(tǒng)化的信息和解決方案。可以期待的是，經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化的酵母體系必將會為藥用蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)帶來重大突破。

作者：常亮劉曉志孟雅娟馬志珺高健單位：華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司抗體藥物研制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室