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《茶葉科學雜志》2016年第二期

摘要：

采用RACE技術，獲得茶樹武夷奇種C18葉片花青素合成途徑中的花青素合成酶（ANS）基因的cDNA全長序列。采用染色體步移技術獲得該基因的啟動子序列。采用實時熒光定量PCR技術檢測該基因在不同遮光處理下的表達動態。結果表明，csans全長cDNA為1000bp，其中ORF（OpenReadingFrame）為957bp，編碼320個氨基酸，含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能結構域；分離得到CsANS基因上游調控序列1010bp，其含啟動子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1（光響應元件）、circadian（生物鐘相關元件）等與花青素合成途徑相關的重要順式作用元件。熒光定量PCR分析表明，該基因在全光照處理（CK）時表達量較高，75%遮光時表達量較低。說明該基因的表達受光照強弱的控制。

關鍵詞：

茶樹；CsANS基因；啟動子；生物信息學分析

茶樹武夷奇種C18，無性系。灌木型，中葉類，中生種。是福建省武夷山市茶葉研究所從武夷群體種中選育的優良品系。芽葉紫紅色，茸毛較密，節稍長。且芽葉生育力強，發芽較密，持嫩性較強，是一種稀有的特色茶樹資源。武夷奇種C18芽葉呈現紅紫色，花青素含量較高[1-2]。研究表明，花青素是茶樹葉片呈現“紅紫色”的主要原因[3]。植物花青素的生物合成途徑已有較為深入的研究，其中花青素合成酶（Anthocyaninsynthase，ANS）是將無色花青素經氧化脫水形成紅紫色花青素的關鍵酶[1]。環境信號激活花青素合成途徑中相關基因的表達[4]。在花青素合成的前期，光能調控相關基因的表達，弱光可以抑制或下調基因的表達，從而減少花青素的合成；而強光可以誘導花青素合成相關基因的表達，使花青素的含量增加[5]。光信號調控轉錄因子與啟動子結合的強弱，并影響結構基因的表達，其表達量也會隨之發生相應的變化[1]。目前在茶樹上，ANS基因的啟動子還未克隆。本研究根據已有的茶樹ANS基因的EST（Expressedsequencetags）序列，采用同源克隆和GenomeWalking方法，克隆了紫葉茶樹的ANS基因及分離5′調控序列，再利用生物信息學法，預測了啟動子的順式作用元件，采用熒光定量PCR技術，分析ANS在不同光照條件下的表達模式，有助于揭示ANS在紫色茶樹葉片對環境信號響應過程中的作用，解析光強對武夷奇種C18ANS基因的調控機理，為紫芽茶樹特異種質的創制和利用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與處理1.1.1植物材料試驗材料為武夷奇種C18，由福建省武夷山市茶葉研究所資源圃提供。選取武夷奇種C18的成熟葉片，迅速用液氮處理，置－80℃冰箱保存,用于基因組DNA的提取，克隆CsANS啟動子序列。

1.1.2遮光處理試驗在福建省武夷山市茶葉研究所資源圃中完成。2015年4月中旬，挑選生長發育良好、整齊一致、樹形基本相似的植株27株，分為3組（每9株為1組，每重復3株），掛牌標記，并對其進行同一高度的修剪。待茶樹芽頭萌動之時，開始遮光處理。設2個處理：分別用75%和60%的黑色遮蔭網遮光，以全光照處理為對照。經過15d的遮光處理，取經遮光處理和全光照處理（CK）的武夷奇種C18葉片（第一葉位），經錫箔紙分裝于－80℃保存，用于熒光定量PCR檢測。

1.1.3試劑FHPlantDNAKit(北京德曼特爾生物科技有限公司)；PrimerStar(TaKaRa公司)；AgaroSeGelDNAExtractionKit(TaKaRa公司)；SMARTerRACE5′/3′Kit(TaKaRa公司)；染色體步移試劑盒(TaKaRa公司)；pEASY-BluntZeroCloningKit(福州都拜特生物技術有限公司)；引物合成及樣品測序由鉑尚生物技術（上海）有限公司完成。

1.2方法

1.2.1茶樹葉片總RNA及基因組DNA的提取本試驗參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取茶樹總RNA；采用FHPlantDNAKit(北京德曼特爾生物科技有限公司)試劑盒提取紫葉茶樹基因組DNA。

1.2.2茶樹CsANS5′RACE、3′RACE及全長ORF的PCR擴增cDNA第一鏈的合成按RevertAidTMFirst-StrandcDNASynthesisKi試劑盒說明書進行。根據已報道的擬南芥、葡萄、茶樹等ANS基因序列，用DNAMAN設計同源克隆引物。上游引物：5′-CAACAATGATGACTACAGTGGCTG-3′，下游引物：5′-GCGCCTTTAGAGCCAAGTTCTTG-3′。PCR擴增體系：12.5µLEx-Taqmix，2µLcDNA模板，0.5µLANS-R，0.5µLANS-F，補ddH2O至25µL體系。94℃預變性4min，94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸3min，35個循環，最后72℃延伸10min進行PCR擴增。在其ORF兩端設計特異引物qANS-R：5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′；qANS-F：5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′擴增全長序列。

1.2.3CsANS基因啟動子的克隆根據TaKaRaGenomeWalkingKit引物設計原則，在已知的茶樹ANS基因（GenBank收錄號為AY830416.1）的已知序列區（最好不少于500bp）分別設計3條反向且退火溫度較高的特異性引物SP1、SP2和SP3，再與試劑盒中提供的4種經過獨特設計的退火溫度較低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4進行熱不對稱PCR反應[6]，經過3次巢式PCR反應獲得已知序列的側翼序列。用于擴增ANS基因啟動子序列的特異性引物情況詳見表1。以提取的武夷奇種C18茶樹葉片DNA為模板，按照TaKaRaGenomeWalkingKit說明和林玉玲等[7]的方法進行ANS基因啟動子的克隆。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶克隆至pMD18-T載體，37℃連接過夜后進行轉化測序（鉑尚生物技術有限公司）。

1.2.4熒光定量PCR表達分析分別提取遮光75%、60%和全光照處理（CK）的武夷奇種C18第一葉位總RNA，用逆轉錄試劑盒（TaKaRa）反轉錄成cDNA，稀釋10倍作模板。以18S-rRNA基因為內參（18SⅠ：5′-CCTGAGAAACGGCTACCACA-3′，18SⅡ：5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′）。運用DNAMAN軟件，按照熒光定量PCR引物設計原則，設計熒光定量PCR引物（ANS-R：5′-GTTGCTGTAATAGGCGATGGTG-3′，ANS-F：5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′）。參照SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit（TaKaRa）說明書，進行熒光定量PCR擴增體系：cDNA模板1µL，2×SYBRPremixEx-TaqTM5µL，上下游引物（10µmol•L-1）各0.2µL，用RNase-freeH2O補足至10µL。95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃復性34s，共40個循環。每份樣品設3次重復。試驗數據應用MicrosoftExcel2007軟件，采用2-ΔΔCt法計算其相對表達量[8]；應用SPSS軟件對結果進行差異顯著性分析。應用MicrosoftExcel2007軟件作柱狀圖。

1.2.5生物信息學分析CsANS序列通過在線NCBI的Blast功能進行氨基酸序列同源性比較；通過Protparam軟件對基因的分子量、等電點進行預測，初步分析目的基因的功能；通過TMHMM和TMPred軟件進行蛋白質跨膜結構的預測；SignalP4.1進行信號肽預測；在線SOPMA預測蛋白質二級結構。ProtCompVersion9.0進行亞細胞定位預測。啟動子序列通過在線PlantCAR[9]及Place軟件[10]預測其順式作用元件的種類、分布情況和生物學功能[11]。通過在線軟件BDGP[12]預測轉錄起始位點及可能的核心啟動子區域。

2結果與分析

2.1茶樹CsANS基因cDNA全長克隆

2.1.1茶樹CsANS基因PCR結果分析經PCR擴增回收測序及使用DNAman軟件拼接獲得CsANS基因全長序列1000bp（GenBank收錄號為KT215319）。（圖1）該序列包含1個完整的閱讀框（15~977bp），編碼320個氨基酸，該基因含有起始密碼子ATG、終止密碼子TAA，并含有保守功能結構域DIOX-N、20G-Fell-Oxy，屬于DIOX-N和20G-Fell-Oxy超級家族。

2.1.2茶樹CsANS基因的進化分析將武夷奇種C18茶樹ANS基因的氨基酸序列與已知的茶樹、高叢越橘（Vacciniumcorymbosum）、和甘薯（Ipomoeabatatas）等11種植物ANS基因的氨基酸序列進行同源進化樹分析（圖3）。發現所克隆的ANS蛋白與同屬茶樹ANS蛋白（登錄號：AY830416.1）的一致性高達100%。與其他物種比較，發現茶樹ANS蛋白在親緣關系上與高叢越橘最近，同源性為78%。

2.1.3CsANS基因氨基酸生物信息學分析通過ProtParam軟件對CsANS氨基酸進行基本信息分析可知，CsANS基因編碼320個氨基酸；相對分子量36113.6kD；理論等電點pI為6.23；負電荷殘基（Asp+Glu）為46個，正電荷殘基（Arg+Lys）為43個；不穩定指數為41.05，屬于不穩定蛋白；脂溶系數為：88.97，平均疏水性（GRAVY）為－0.397；分子式：C1626H2576N432O472S12，總原子數為5118，氨基酸組成中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的10.3%；其次為甘氨酸，占6.9%，其他氨基酸占82.8%。利用在線軟件TMHMMServerv.2.0工具預測CsANS蛋白的跨膜螺旋區，如圖4顯示，該蛋白不是膜蛋白，無跨膜螺旋區。使用TMpred預測也顯示蛋白都分布在膜外，無跨膜蛋白。通過在線軟件COILS對CsANS氨基酸預測，在CsANS蛋白的25個氨基酸左右預測到強超螺旋信號。經過SignalP-4.1預測信號肽顯示，CsANS編碼的氨基酸不含信號肽，不是分泌蛋白。對氨基酸的二級結構預測顯示CsANS編碼的氨基酸中α螺旋結構較多，有125個占所有氨基酸的39.06%，其次為無規則卷曲占31.87%，延伸鏈占17.81%，β折疊所占比例最低為11.25%。通過ProtCompVersion9.0軟件進行亞細胞定位預測，其亞細胞定位在細胞質。

2.2CsANS基因啟動子克隆

2.2.1CsANS基因啟動子擴增結果以武夷奇種C18的DNA為模板，經3輪巢式PCR反應后，擴增到1條大于1000bp的目的片段（圖5）。將該片段進行克隆、測序，結果顯示，獲得的片段實際長度為1236bp。序列經過分析整理后，以ATG為起始位點，得到茶樹CsANS上游長度為1010bp的DNA序列。

2.2.2茶樹CsANS啟動子轉錄起始位點的預測經過啟動子轉錄起始位點在線預測，茶樹CsANS基因1010bp的5′端調控序列可能存在3處核心啟動子區域，位于35~85、316~366、480~530bp，分值分別為0.96、1和0.88，可能的轉錄起始位點分別為G、C和T。此結果可推測位于316~366bp的序列很可能就是該基因真正的核心啟動子區域，轉錄起始位點為位于第357bp的C（圖6）。

2.2.3茶樹CsANS基因啟動子順式元件分析啟動子生物學功能的在線預測結果表明，CsANS基因啟動子區域中，除了含有大量的核心啟動子元件如CAAT-box和TATA-box之外，還存在多種順式元件，如脫落酸相關元件ABRE，厭氧誘導相關的元件ARE，熱應激反應相關元件HSE，晝夜控制調節元件circadian，低溫應答元件LTR，光響應相關元件Sp1、ACE、I-box及MYB結合位點等（表2）。

2.3相對熒光定量PCR表達分析以18S-rRNA為內參，采用實時熒光定量PCR對不同遮光處理及未處理的武夷奇種C18葉片CsANS基因表達進行了分析，結果（圖7）表明，其表達量在全光照處理（CK）時較高，75%遮光時較低。隨著遮光度增加，呈現下調趨勢。說明茶樹葉片在光照強時花青素合成酶（ANS）表達量高，光照弱時表達量低。

3討論

CsANS是紫葉茶樹花青素合成的最后一個酶，也是將無色花青素經氧化脫水形成紅紫色花青素的最關鍵酶，此中間產物進一步與3-O-葡萄糖基轉移酶（3GT）偶聯并且被傳送到液泡中，形成顯色的3-O-糖苷化花青苷[13]，在植物色澤形成中具有重要作用[14]。ANS基因最初是利用轉座子標簽技術從玉米的A2突變體中鑒定和克隆得到[15]，近年來在茶樹（AY830416.1）、擬南芥（AT4G2288）、小麥（T.aestivum，AB247921）[16-17]等多種植物中也已經得到其克隆。本研究從武夷奇種C18中克隆得到了CsANS的cDNA全長序列，該基因編碼的蛋白具有典型ANS蛋白的保守結構域：DIOX-N、20G-Fell-Oxy。DIOX-N（嗎啡合成非血紅素加氧酶的N-末端）是蛋白質與2-酮戊二酸/鐵（Ⅱ）依賴性雙加氧酶活性的高度保守的N-末端區域。2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結構域由2-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依賴的氧化酶超家族組成，該家族包括脯氨酰4-羥化酶α亞基的C末端。全酶由一個α2β2復合物組成，α亞基是其主要的活性位點。能夠催化反應：前膠原L-脯氨酸+2-酮戊二酸+O2=前膠原反式-4-羥基-L-脯氨酸+琥珀酸+CO2[14]。與其他已知的ANS蛋白相比，CsANS編碼的氨基酸具有較高的同源性，它與高叢越橘（JN654701.1）的同源性較高，一致性為78%。所以推斷CsANS與高叢越橘中典型的花青苷元合成酶基因的生物學功能類似。環境信號激活花青素苷合成途徑，并促使茶樹葉片開始積累花青素[18-20]。

不同的外界環境因子下，葉色會隨之改變。光照是影響花青素苷合成最重要的環境因子之一。Hong等[21]對茶樹進行暗光處理后發現ANS基因表達水平下降。Rosati等[17]從連翹中克隆得到ANS基因，并證明在Forsythin的花瓣中由于缺少ANS基因，所以形成無花色素苷。結合實時熒光定量PCR數據可以看出：不同遮光處理及全光照處理的武夷奇種C18葉片中CsANS基因均有表達；全光照處理下，ANS基因表達量較高，75%遮光時較低，且遮光度增加，ANS基因表達量減少。這表明光照強時ANS基因表達量較高，光照弱時ANS基因表達量較低；CsANS基因對于武夷奇種C18葉片色澤形成過程可能起主要作用，推斷與其基因的催化功能吻合。近年來ANS啟動子在洋蔥（AlliumcepaL.）、三色堇（Viola×wittrockianaGams.）、紫心甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]中已經得到克隆[22-24]。洋蔥、紫心甘薯和三色堇的ANS啟動子除含有多個CAAT-box、TATA-box等基本啟動子元件外，還含有與MYB轉錄因子結合的元件，以及參與光響應、逆境、激素應答的順式作用元件。這與本研究中武夷奇種C18的ANS啟動子發現的順式作用元件相符，說明不同植物間ANS基因功能類似。武夷奇種C18的ANS啟動子中發現了6種與光反應調控有關的順式作用元件，結合CsANS基因在不同光強下表達量的變化，可以推測ANS是個受光照調控的基因。ANS基因在其他物種中參與光反應的研究已有報道[25-26]，而從啟動子角度來研究這類基因功能還鮮有報道，本實驗下一步可以構建ANS基因的啟動子缺失載體，轉化到植株中，通過光照處理研究該啟動子是否為光誘導型啟動子，確定啟動子核心啟動區，對光照調控ANS基因的原理加以闡釋。

作者：金琦芳 陳志丹 孫威江 林馥茗 薛志慧 黃艷 唐秀華 單位：福建農林大學園藝學院 福建農林大學安溪茶學院 閩臺特色作物病蟲害生態防控協同創新中心