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本文作者：王鵬宋宗華李清果德安錢忠直畢開(kāi)順單位：沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院沈陽(yáng)國(guó)家藥典委員會(huì)北京中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所上海

在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中,一項(xiàng)重要的工作就是要對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中涉及到的分析方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,以保證所用的分析方法能夠準(zhǔn)確可靠地控制藥品質(zhì)量。5中國(guó)藥典62005年版一部新增了中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[1],該指導(dǎo)原則將范圍與線性分列,線性指測(cè)試結(jié)果與供試品中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度,而范圍指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性時(shí),測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。原則中對(duì)需要驗(yàn)證的分析方法與驗(yàn)證的具體指標(biāo)做了比較詳細(xì)的闡述,但中藥化學(xué)成分復(fù)雜,被測(cè)成分含量往往較低,且含量差異較大,考察范圍如何確定與其驗(yàn)證方法目前尚無(wú)統(tǒng)一的說(shuō)明。文中亦未涉及各具體指標(biāo)在驗(yàn)證時(shí)可接受的標(biāo)準(zhǔn),國(guó)際上已頒布的指導(dǎo)原則中也未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的要求[2]。本文以厚樸藥材為例,主要研究精密度、準(zhǔn)確度和范圍的具體考察方法,為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的修訂提供數(shù)據(jù)支持。

1儀器與試藥

Agilent1100系列高效液相色譜系統(tǒng),Agilent1100高效液相色譜化學(xué)工作站;SARTORIUSCP225D型天平(德國(guó)賽多利斯公司);YB-1A真空恒溫干燥箱(天津市鑫洲科技有限公司);SZ-93A自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。對(duì)照品厚樸酚(批號(hào)110729-200310)和厚樸酚(批號(hào)110730-200609)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用;厚樸藥材經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)孫啟時(shí)教授鑒定為厚樸MagnoliaofficinalisRehd1etWils;甲醇為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司);水為二次重蒸水。

2色譜條件

色譜柱:KromasilC18柱(416mm@200mm,5Lm);流動(dòng)相:甲醇-水(78B22);檢測(cè)波長(zhǎng):294nm；流速:110mL#min-1;柱溫:35e;進(jìn)樣量:5LL。在此條件下,厚樸酚、和厚樸酚色譜峰與相鄰峰之間分離度均大于115,峰形對(duì)稱,理論板數(shù)按厚樸酚計(jì)算不低于3800,色譜圖見(jiàn)圖1。

3溶液的制備

3.1對(duì)照品溶液的制備取厚樸酚對(duì)照品、和厚樸酚對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇分別制成含厚樸酚11125g#L-1、和厚樸酚01996g#L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置50mL量瓶中,加甲醇制成含厚樸酚13510mg#L-1、和厚樸酚79165mg#L-1的混合對(duì)照品溶液。

3.2供試品溶液的制備取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約012g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,搖勻,密塞,浸漬24h,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液5mL,置25mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。

4方法學(xué)考察

4.1線性關(guān)系考察精密量取對(duì)照品溶液015、110、210、410、810、10mL,分別置10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積,以對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。厚樸酚回歸方程為:A=61786C-11764(r=11000);和厚樸酚回歸方程為:A=61686C-11008(r=11000)。結(jié)果表明:厚樸酚、和厚樸酚分別在61750~13510mg#L-1、31982~79165mg#L-1范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

4.2精密度試驗(yàn)

4.2.1儀器精密度精密吸取低、中、高濃度混合對(duì)照品溶液(含厚樸酚濃度分別為61750、27100、10810mg#L-1;含和厚樸酚濃度分別為3198215193、63172Lg#mL-1),在上述色譜條件下,分別重復(fù)進(jìn)樣6次,計(jì)算色譜峰面積RSD,厚樸酚分別為018%、019%、018%;和厚樸酚分別為019%、017%、110%。

4.2.2方法重復(fù)性考察¹制備同一濃度6份樣品的測(cè)定結(jié)果(n=6)。取同一批厚樸樣品約012g,精密稱定,按/3120項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積,計(jì)算厚樸酚、和厚樸酚的含量和RSD,結(jié)果見(jiàn)表1。º制備三個(gè)不同濃度共9份樣品的測(cè)定結(jié)果(n=9)。在10倍范圍內(nèi),按/3120項(xiàng)下方法平行制備低、中、高濃度供試品溶液,重復(fù)3次,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積,計(jì)算厚樸酚、和厚樸酚的含量和RSD,結(jié)果見(jiàn)表2。

4.3加樣回收率考察

4.3.1制備同一濃度6份樣品的測(cè)定結(jié)果(n=6)。稱取已知含量的厚樸樣品011g,精密稱定,共6份,每份分別精密加入厚樸酚對(duì)照品溶液2ml與和厚樸酚對(duì)照品溶液112mL,按/3120項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。

4.3.2制備三個(gè)不同濃度共9份樣品的測(cè)定結(jié)果(n=9)。稱取已知含量的厚樸樣品011g,精密稱定,共9份,平均分為3組,每組分別精密加入對(duì)照品溶液適量,按/3120項(xiàng)下方法平行制備成低、中、高3個(gè)濃度的供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表4。分別稱取已知含量的厚樸樣品0103g、011g、013g,各3份,精密稱定,共9份,每份分別精密加入對(duì)照品溶液適量,按/3120項(xiàng)下方法平行制備成低、中、高3個(gè)濃度的供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表5。稱取已知含量的厚樸樣品0105g,精密稱定,共9份,平均分為三組,每組分別精密加入對(duì)照品溶液適量,按/3120項(xiàng)下方法平行制備成低、中、高3個(gè)濃度的供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表6。0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣,按上述色譜條件測(cè)定,厚樸酚、和厚樸酚峰面積RSD分別為018%、017%,表明在12h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

5結(jié)果與討論

5.15中國(guó)藥典62005年版一部厚樸項(xiàng)下規(guī)定,本品按干燥品計(jì)算,含厚樸酚與和厚樸酚的總量不得少于210%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道厚樸中這兩種成分含量差異較大[3,4],本文選取藥典規(guī)定低限的50%為最低點(diǎn),擴(kuò)大至10倍范圍,考察重復(fù)性和回收率。結(jié)果表明重復(fù)性RSD值隨考察范圍增大而增大,且同一濃度6份供試品溶液的測(cè)定結(jié)果與低、中、高濃度9份供試品溶液的測(cè)定結(jié)果方差非齊性(P<0105)。范圍擴(kuò)大后,測(cè)得高濃度樣品含量降低,說(shuō)明對(duì)于含量高的樣品存在溶劑不能提取完全的可能?；厥章蔙SD值亦隨考察范圍增大而增大。當(dāng)藥材取樣量不同,根據(jù)被測(cè)成分含量按1:1添加對(duì)照品時(shí),誤差影響相對(duì)較小。而當(dāng)確定相同取樣量,通過(guò)改變對(duì)照品加入量考察回收率時(shí),發(fā)現(xiàn)當(dāng)考察范圍擴(kuò)大后,低濃度供試品溶液回收率明顯降低,9份樣品測(cè)定結(jié)果RSD明顯增大,加入對(duì)照品的量相對(duì)于藥材中原含量越少,回收率越低,所得RSD值越大。對(duì)照品加入量過(guò)低,相對(duì)誤差較大。建議中藥化學(xué)成分定量分析時(shí)建立分析方法適用范圍不宜過(guò)寬,對(duì)于含量相差較大樣品可進(jìn)行稀釋后在適宜范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

5.2重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示,RSD值隨考察范圍增大而增大,而樣品含量降低,但加樣回收試驗(yàn)結(jié)果并未顯示相應(yīng)范圍內(nèi)回收率降低。說(shuō)明直接添加對(duì)照品與從細(xì)胞中提取被測(cè)成分是兩個(gè)不同的過(guò)程,被測(cè)成分的提取過(guò)程會(huì)受到其他成分和細(xì)胞結(jié)構(gòu)等的影響。

5.3中藥化學(xué)成分復(fù)雜,被測(cè)成分含量往往較低,且含量差異較大,考察范圍如何確定與其驗(yàn)證方法目前尚無(wú)統(tǒng)一的說(shuō)明。本文對(duì)范圍的確證進(jìn)行了初步探討,在所建立的范圍內(nèi),考察6份和9份測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)的差異和RSD值,研究9份評(píng)價(jià)高低濃度的選擇方法,對(duì)擴(kuò)大考察范圍后的精密度和準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估,以期為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的修訂和完善提供數(shù)據(jù)支持。