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作者：李倩，王繼紅，程梅，王欣，曾建濤

【摘要】目的：觀察高濃度葡萄糖對人肝細胞株（L02）及胰島素抵抗細胞模型（IRL02）的血管生成素樣蛋白3（ANGPTL3）表達的影響，探討ANGPTL3與糖尿病（DM）并發高脂血癥的關系，在細胞水平分析DM并發高脂血癥的分子機制.方法：以L02為研究對象，并建立胰島素抵抗模型（IRL02）.L02和IRL02兩組細胞分別在含5.6，7.0，11.1，28.0和33.0mmol/L葡萄糖的培養液中培養，5.6mmol/L組作為對照組.用RTPCR方法檢測ANGPTL3的mRNA表達量，并用WesternBlot方法檢測ANGPTL3蛋白質表達水平，分析ANGPTL3與DM并發高脂血癥的關系.結果：高濃度葡萄糖可促進L02和IRL02兩組細胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質表達，并呈一定的量效關系，變化差異均有統計學意義（P<0.0001）；IRL02細胞對葡萄糖的刺激尤為敏感（P<0.0001）.結論：高濃度葡萄糖可上調ANGPTL3的基因和蛋白質表達，其在DM并發高脂血癥中可能起重要作用.

【關鍵詞】血管生成素樣蛋白3；糖尿病；高脂血癥；葡萄糖；胰島素抗藥性

0引言

人血管生成素樣蛋白3（angiopoientinlikeprotein3，ANGPTL3）是Mr約為70ku的分泌蛋白，由460個氨基酸組成，其氨基端的螺旋樣結構域與調節脂質代謝的功能相關，主要在肝臟中表達［1］.ANGPTL3可通過抑制脂蛋白脂肪酶（lipoproteinlipase，LPL）的活性導致以極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein，VLDL）三酰甘油升高為主的高脂血癥.脂代謝與糖代謝在多個環節相互作用，共同影響糖尿病（diabetesmellitus，DM）的發生與發展.血脂異常是DM的危險因素，而有關ANGPTL3與DM相關性的研究目前國內外都極少報道.本實驗通過研究高糖環境下人肝細胞株（L02）及其胰島素抵抗細胞模型（insulinresistantL02，IRL02）ANGPTL3的mRNA和蛋白表達量變化，分析葡萄糖對該基因表達的影響，擬從分子水平探討ANGPTL3在DM并發高脂血癥中的病理生理作用.

1材料和方法

1.1材料L02（重慶醫科大學基礎研究所）；RPMI1640培養基，1∶125胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；RTPCR試劑盒（寶生物大連有限公司）；ANGPTL3基因引物和βActin引物，胰島素（上海生物工程技術服務有限公司）；ANGPTL3小鼠mAb和βActin小鼠mAb（英國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠mAb，PVDF膜（北京鼎國生物制品公司）；免疫印跡（WesternBlot）試劑盒（SantaCruz公司）.PCR儀，微型電轉移裝置，GelDoc100凝膠成像儀（美國BioRad公司）.

1.2方法

1.2.1細胞培養和胰島素抵抗模型的建立L02細胞用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液在50mL/LCO2,37℃條件下培養，選取對數生長期的細胞用于實驗.用含5×10-7mol/L胰島素的培養液培養16h的L02細胞代替胰島素抵抗模型，稱為IRL02細胞，以在不含胰島素的培養液中培養16h的L02細胞為對照.細胞計數,接種后隨機分為L02細胞組和IRL02細胞組.其中L02細胞組在上述條件培養16h，更換無血清培養液培養24h后，又分為G1~G5五個亞組，分別用含5.6，7.0，11.1，28.0，33.0mmol/L的葡萄糖培養液培養24h，設G1為對照組.IRL02細胞組：除用含5×10-7mol/L胰島素的培養液替換胎牛血清培養L02細胞外，其它培養條件和時間與L02細胞組完全相同，同樣分為IRG1~G5五個亞組，設IRG1為對照組.

1.2.2RTPCR檢測ANGPTL3的mRNA表達量按總RNA抽提試劑盒說明操作提取細胞總RNA，用UV法定量分析RNA得率和純度，瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性.cDNA合成（10μL反應體系）：取MgCl22μL，10×RT緩沖液1μL，無核酸酶蒸餾水3.75μL，dNTP混合液1μL，RNA酶抑制劑0.25μL，AMV逆轉錄酶0.5μL，隨機引物0.5μL，總RNA(300ng)1μL.逆轉錄反應條件：30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min，所得產物用于PCR擴增.PCR反應：采用PrimerPremier5.0軟件設計ANGPTL3引物和βActin引物.ANGPTL3上游引物序列：5′TCCAGAACACCCAGAAGTAAC3′，下游引物序列:5′CCAGCCTCCTGAATAACCCT3′；βActin上游引物序列:5′TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA3′，下游引物序列：5′TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3′.ANGPTL3和βActin反應同管進行，終體積50μL.PCR反應條件：94℃2min，1個循環；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35個循環.取8μL反應液進行25g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統采集圖片，QuantityOne軟件分析，將ANGPTL3與βActin面積灰度值的比值作為ANGPTL3的mRNA表達量參數.

1.2.3WesternBlot檢測細胞ANGPTL3的蛋白質表達量提取細胞總蛋白質，Lowry法測定總蛋白濃度.WesternBlot：蛋白質提取液（含60μg總蛋白）與5×SDS上樣緩沖液按體積比4∶1混合，常規處理后進行100g/LSDS聚丙烯酰胺電泳，電轉過夜，將蛋白質轉至PVDF膜.常規WesternBlot方法操作，ANGPTL3

mAb1∶1000稀釋，βActinmAb1∶5000稀釋，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠mAb1∶5000稀釋.凝膠成像系統采集圖像，QuantityOne軟件分析，ANGPTL3與βActin的面積灰度值比值作為ANGPTL3的蛋白質表達參數.

統計學處理：數據用x±s表示，用SAS9.1軟件分析，采用析因設計方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義.

2結果

2.1實驗整體統計結果由表1可見，隨著葡萄糖濃度增加，L02細胞及IRL02細胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質表達量也隨之增加，對mRNA表達影響的析因設計方差分析結果為F=84.14,P<0.0001；對蛋白質表達影響分析結果為F=115.93,P<0.0001，差異均有統計學意義.在mRNA水平，葡萄糖濃度的影響：F=178.67，P<0.0001；細胞組間比較：F=6.33，P<0.05；葡萄糖濃度與細胞組比較：F=9.07，P=0.0002.即葡萄糖對ANGPTL3的mRNA表達有明顯影響，在葡萄糖不同濃度組、不同細胞組和兩者的交互作用方面差異均有統計學意義.在ANGPTL3蛋白質表達方面，葡萄糖濃度變化對ANGPTL3表達影響的F=181.05；細胞組間比較F=194.72；濃度與細胞組間比較F=31.11，三者差異均有統計學意義（P<0.0001）.表1葡萄糖對L02細胞和IRL02細胞ANGPTL3表達的影響

2.2不同濃度葡萄糖對L02細胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質表達的影響結果顯示，在mRNA水平，G2組與G1組比較，雖然表達量有升高，但兩個亞組間差異無統計學意義（P>0.05）.說明ANGPTL3的基因表達對低葡萄糖濃度刺激不太敏感；而G3~G5組與G1組比較，差異均有統計學意義（P<0.0001）.5個亞組間任意兩組兩兩比較，差異均有統計學意義（P<0.05），即當葡萄糖濃度升至11.1~33.3mmol/L時，L02細胞ANGPTL3的mRNA表達升高（表1,圖1）.在蛋白質表達水平，G2~G5組與G1組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；此外G1~G5組各組間兩兩比較，除G4組與G5組呈現表達量雖升高，但差異無統計學意義（P>0.05）外，其它各組間差異均有統計學意義（P<0.05），顯示高濃度葡萄糖可促進L02細胞ANGPTL3蛋白質的表達（表1，圖2）.

2.3不同濃度葡萄糖對IRL02細胞ANGPTL3表達的影響在IRG1~IRG5五個亞組細胞間ANGPTL3的mRNA和蛋白質表達量比較（表1，圖3），差異均有統計學意義（P<0.0001，）.在mRNA水平，IRG2~IRG5各組與IRG1組間比較，以及各亞組間兩兩比較，差異均有統計學意義（P<0.0001），顯示高糖可明顯刺激IRL02細胞ANGPTL3的mRNA表達，使其顯著升高.在蛋白質表達水平（表1，圖4），IRG2~IRG5各組與IRG1組比較差異均有統計學意義（P<0.0001），即隨培養液中葡萄糖濃度的增加，ANGPTL3蛋白質的表達明顯升高.IRG2，IRG3和IRG5組組間兩兩比較顯示差異有統計學意義（P<0.0001）；IRG3與IRG4，IRG4與IRG5組比較差異無統計學意義（P>0.05）.顯示在極高濃度葡萄糖環境中，ANGPTL3蛋白質表達數量的增加已受到限制.

2.4同濃度葡萄糖對L02和IRL02兩組細胞ANGPTL3表達的影響兩組細胞ANGPTL3的mRNA表達，除葡萄糖濃度5.6mmol/L組IRL02細胞的表達量低于L02細胞外；其它各組均呈現IRL02細胞表達量明顯高于L02細胞(表1).比較同葡萄糖濃度兩組細胞mRNA表達量，結果顯示，除7.0mmol/L和11.1mmol/L組IRL02細胞的表達雖比L02細胞增高，但差異無統計學意義（P>0.05）外；其余三組葡萄糖濃度對任意兩組細胞的影響差異均有統計學意義（P<0.05）.在ANGPTL3蛋白質表達水平，IRL02細胞的表達量除葡萄糖5.6mmol/L組低于L02細胞外，其它各組ANGPTL3的表達均明顯高于L02細胞組（表1），且各濃度葡萄糖對兩組細胞ANGPTL3表達的影響除葡萄糖5.6mmol/L組外，其它組組間差異均有統計學意義（P<0.0001）.

3討論

DM導致患者死亡的最常見原因是心血管并發癥，2型DM患者約有58%死于動脈粥樣硬化性心血管病，其特征是胰島素（相對）缺乏和胰島素抵抗，而胰島素抵抗常引起內源性胰島素過渡分泌，嚴重的高胰島素血癥因對LPL的激活作用明顯減弱可引起三酰甘油水平升高［2］，并與血糖控制不滿意密切相關.本研究結果顯示，高糖可明顯刺激L02細胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質表達，在IRL02細胞高糖對該基因的上調作用更加明顯，說明ANGPTL3基因的表達在體內極可能受血糖的調控，提示高血糖可以通過上調ANGPTL3的表達促進高脂血癥的發生與發展，ANGPTL3與DM及其相關高脂血癥密切相關.實驗結果還顯示，當環境葡萄糖濃度升高到7.0~33.0mmol/L時，IRL02的ANGPTL3基因和蛋白質表達量都顯著增加，并有劑量依賴性，但當細胞處于葡萄糖濃度為5.6mmol/L時，ANGPTL3的基因和蛋白質表達反而降低，說明良好地控制血糖對預防DM脂代謝紊亂有重要意義.有關胰島素抵抗血糖異常狀態下，胰島素信號通路可能通過上調ANGPTL3的表達導致血脂升高的具體機制我們正在進一步研究.

ANGPTL3大量表達可引發三酰甘油升高為主的高脂血癥［3］.而高三酰甘油血癥參與了一系列代謝性疾病的發病過程［4-5］.ANGPTL3的大量表達還可促進脂肪細胞的脂解作用，釋放大量FFA［6］，而FFA是肥胖導致IR的一項重要因素［7］；攝入高脂飲食和循環中的游離脂肪酸濃度增高可導致外周組織和肝臟的胰島素抵抗，進而產生2型DM和代謝綜合征［8］.我們的研究結果提示，胰島素抵抗引發的高血糖狀態可通過上調ANGPTL3的表達，導致循環中三酰甘油和FFA增高，發生高脂血癥，而增高的三酰甘油和FFA又加重了肝臟及外周組織的胰島素抵抗，形成惡性循環，互為因果.有研究還發現ANGPTL3基因是L

XR的直接靶點［9-11］.對LXR的研究發現葡萄糖是其內源性配基［12］，提示葡萄糖上調ANGPTL3的表達機制可能與LXR有關.

綜上所述，ANGPTL3可能是DM和高脂血癥發生、發展和橋接的關鍵點，對于ANGPTL3的基礎研究有助于DM，高脂血癥等代謝性疾病的病因學的發展，而針對ANGPTL3表達的調控和干預有望成為治療這類疾病的新型治療手段和途徑.

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