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【摘要】目的：采用RTPCR方法來(lái)探討桂枝湯對(duì)脾虛NFATmrna，IL4mRNA，IFNγmRNA的影響以及干預(yù)Th1/Th2細(xì)胞漂移的機(jī)制.方法：40只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A組)、脾虛組(B組)、桂枝湯大劑量組(C組)和桂枝湯小劑量組(D組)等4組，每組10只；用規(guī)范的脾氣虛證大鼠模型造模方法將B，C和D組大鼠造模，B，C和D組分別用蒸餾水、桂枝湯大劑量、桂枝湯小劑量灌胃，標(biāo)本采集后用RTPCR檢測(cè)NFATmRNA，IL4mRNA和IFNγmRNA表達(dá)水平.結(jié)果：脾虛組的NFATmRNA，IL4mRNA表達(dá)上調(diào)；而IFNγmRNA表達(dá)下調(diào)，經(jīng)桂枝湯大、小劑量組治療后，NFATmRNA，IL4mRNA表達(dá)下調(diào)，IFNγmRNA表達(dá)上調(diào).結(jié)論：桂枝湯對(duì)Th1/Th2細(xì)胞漂移作用途徑可能是通過(guò)下調(diào)NFATmRNA的表達(dá)，恢復(fù)了IFNγmRNA正常轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而下調(diào)IL4mRNA的表達(dá)，使脾虛大鼠Th1/Th2細(xì)胞達(dá)到一種新的平衡.

【關(guān)鍵詞】桂枝湯；活化T細(xì)胞核因子；白細(xì)胞介素4；γ干擾素

0引言

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，在生理?xiàng)l件下，Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞分泌的兩類因子互相調(diào)整，相互制約，處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài).一旦兩者平衡失調(diào)，細(xì)胞因子作用于細(xì)胞表面相應(yīng)受體，活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(signaltransducerfactor,STF)，將刺激信號(hào)傳至核內(nèi)而發(fā)揮其基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用，使機(jī)體局部乃至全身發(fā)生病理反應(yīng)［1］.我們通過(guò)觀察脾虛證模型動(dòng)物Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞中具有代表性的γ干擾素(interferonγ，IFNγ)、白介素4(interleuin4，IL4)以及T細(xì)胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcells,NFAT)mRNA的表達(dá)以及桂枝湯對(duì)三者的影響，探討脾虛證模型動(dòng)物與Th1/Th2細(xì)胞漂移的關(guān)系以及桂枝湯對(duì)其的逆轉(zhuǎn)作用.

1材料和方法

1.1材料SD大鼠40只，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量200~300g，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.在江西中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清結(jié)級(jí)25~27℃條件下飼養(yǎng).SD大鼠在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1wk后，稱質(zhì)量并隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組），脾虛模型組（B組），桂枝湯大劑量組（C組），桂枝湯小劑量組（D組），每組10只.桂枝湯中桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗購(gòu)于江西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，按《傷寒論》原方10∶10∶7∶10∶10（W/W）配比混合藥物(大棗剖開)置于燒杯中.加入5倍蒸餾水冷浸60min，快速加熱至沸騰，而后保持微沸狀態(tài)15min，趁熱抽濾，藥渣中加入3倍蒸餾水，浸泡30min，快速加熱至沸，微沸10min，趁熱抽濾，棄藥渣，合并濾液，水浴濃縮相當(dāng)于生藥1kg/L的濾液，4℃保存.主要試劑與儀器有卵清蛋白、刀豆蛋白A（均為Sigma公司），Trizol(GibcoBRL公司)，Rmasin,MMLV（Promega公司），Tag酶（上海生工），并由上海生工合成引物，DNAmark(北京鼎國(guó)生物試劑公司)，PCR儀（PE480美國(guó)PERKINELMER公司），紫外分光光度儀（DU530美國(guó)BECKMAN公司），EagleEyeII成像分析系統(tǒng)(美國(guó)).

1.2方法

1.2.1模型建立先按初步規(guī)范的脾氣虛證大鼠模型造模方法建模［2］.造模30d后大鼠表現(xiàn)符合中醫(yī)學(xué)中的脾虛癥狀.

1.2.2給藥除A組10只大鼠不需造模外，B，C和D組共30只大鼠按文獻(xiàn)［2］方法造模30d.A組大鼠胃飼蒸餾水2.5mL，2次/d，連續(xù)14d；成模后B組大鼠灌服蒸餾水2.5mL，2次/d，連續(xù)14d；成模后C組大鼠灌服桂枝湯濾液，約為6g/kg［3］，2次/d，連續(xù)喂藥液14d；成模后D組大鼠灌服桂枝湯濾液，約為3g/kg，2次/d，連續(xù)喂藥液14d(C，D兩組給藥劑量按人與動(dòng)物間體表面積折算).

1.2.3細(xì)胞懸濁液的制備采用常規(guī)方法,大鼠拉頸處死,無(wú)菌條件下剪開腹腔取出脾臟研磨,在100目銅網(wǎng)上輕輕擠壓，培養(yǎng)基上培育并制成細(xì)胞懸液,用低滲壓除去紅細(xì)胞,以Hanks液洗滌,配成1×1010/L及2×1010/L脾細(xì)胞懸液.濾過(guò)后將收集的脾細(xì)胞懸液加到淋巴細(xì)胞分離液中，吸出中間灰白色細(xì)胞層，用尼龍毛柱T細(xì)胞分離法分離T淋巴細(xì)胞［4］.

1.2.4增殖刺激重懸T淋巴細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×109/L，用臺(tái)盼藍(lán)染色，活性細(xì)胞＞95%，置于24孔培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液1mL，各組內(nèi)加入卵清蛋白至終濃度0.2g/L，刀豆蛋白A25mg/L，37℃50mL/LCO2孵箱中孵育24h.

1.2.5RTPCR（逆轉(zhuǎn)錄）將收集培養(yǎng)后的細(xì)胞調(diào)成細(xì)胞懸液，用Trzol提取總RNA，紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定RNA的濃度和純度，-70℃凍存?zhèn)溆?用2μL逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-70℃凍存?zhèn)溆?用5μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并以βactin為內(nèi)對(duì)照.IL4，IFNγ和NFAT的引物參照?qǐng)?bào)道［5-7］設(shè)計(jì)，βactin引物參照Genebank中cDNA序列，具體序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1.βactin反應(yīng)條件：94℃30s變性，50℃30s退火，72℃3min延伸；PCR反應(yīng)條件：94℃5min變性，然后35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，最后延伸72℃10min.IFNγ每一個(gè)循環(huán)包括94℃45s，56℃45s，72℃90s；IL4每一循環(huán)包括94℃45s，55℃45s，72℃90s，NFATc每一循環(huán)包括94℃1min，55℃1min，72℃2min.表1PCR所有引物及擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.2.6PCR擴(kuò)增反應(yīng)半定量分析5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖電泳，溴化乙啶染色，能過(guò)圖像分析軟件讀取目的電泳帶A值，將目的條帶與βactin條帶的比值作為目的基因mRNA的表達(dá)量，目的基因mRNA的表達(dá)量=目的條帶A值/βactin條帶A值.

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統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料以x±s表示，組間比較用SPSS軟件包進(jìn)行方差分析及SNKq檢驗(yàn).

2結(jié)果

實(shí)驗(yàn)各組的NFATmRNA，IL4mRNA，IFNγmRNA的影響(表2).B組的NFATmRNA，IL4mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05）；而IFNγmRNA表達(dá)下調(diào)（P<0.05），經(jīng)C組治療后，NFATmRNA，IL4mRNA表達(dá)下調(diào)（P<0.05），IFNγmRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05），與正常組相比較，基本恢復(fù)了正常水平（P>0.05）.IFNγ，IL4，NFAT及βactin的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖電泳，所示條帶分別為405,360,392和512bp，符合設(shè)計(jì)的片段（圖1～3）.表2實(shí)驗(yàn)各組NFATmRNA,IL4mRNA及IFNγmRNA的表達(dá)

3討論

1986年Mosman等［6］證實(shí)CD4+（Thelper,Th）可以發(fā)展成功能不同的Th1和Th2亞群，它們各自產(chǎn)生特征性細(xì)胞因子.Th1細(xì)胞主要分泌干擾素γ(interferonγ,IFNγ),IL2,IL12等多種Th1型細(xì)胞因子；Th2細(xì)胞分泌的IL4，IL5，IL10等多種Th2型細(xì)胞因子.Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子的交互調(diào)節(jié)而互為調(diào)節(jié)細(xì)胞,從而形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，例如由Th1細(xì)胞分泌的IFNγ是Th1細(xì)胞分化的重要的細(xì)胞因子，它可抑制Th2細(xì)胞的分化.IL4和IL10是Th2細(xì)胞分化的重要的細(xì)胞因子，可抑制Th1細(xì)胞的分化［1］.

活化T細(xì)胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcells，NFAT)是一類與眾多信號(hào)傳導(dǎo)途徑相聯(lián)系，具有廣泛生理功能的轉(zhuǎn)錄因子［8］.NFAT可以選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞因子和其他免疫調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，從而在免疫應(yīng)答過(guò)程中扮演著中心角色［9］.

“脾”的防衛(wèi)功能與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫功能有許多相似之處，脾與免疫功能之間的關(guān)系非常密切［10］.桂枝湯組方多以調(diào)補(bǔ)脾胃藥為基礎(chǔ)，桂枝湯以甘草、大棗、生姜三味藥升騰脾胃清陽(yáng)之氣，培中土，滋化源，故可改善脾虛狀況，增強(qiáng)人體免疫力.桂枝湯治療前，脾虛組的NFATmRNA，IL4mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05）；而IFNγmRNA表達(dá)下調(diào)（P<0.05），說(shuō)明了脾虛大鼠Th1/Th2細(xì)胞失去了平衡，Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，Th細(xì)胞向Th1分化途徑受到抑制，此時(shí)，Th2應(yīng)答占優(yōu)勢(shì).其機(jī)制可能是脾虛大鼠調(diào)節(jié)因子NFAT表達(dá)上調(diào)，其通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑阻斷誘導(dǎo)IFNγ的表達(dá)，解除了對(duì)IL4表達(dá)的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，從而使IFNγ的表達(dá)下調(diào)，IL4的表達(dá)上調(diào)；經(jīng)桂枝湯大小劑量組治療后，NFATmRNA，IL4mRNA表達(dá)下調(diào)（P<0.05），IFNγmRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05），與正常組相比較，基本恢復(fù)了正常水平（P>0.05），說(shuō)明了桂枝湯可以誘發(fā)Th1優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，抑制Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，最終使脾虛大鼠Th1/Th2細(xì)胞達(dá)到一種新的動(dòng)態(tài)平衡.

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