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【摘要】骨髓間充質干細胞（BMSCs）作為龐大干細胞家族中的一名重要成員，具有極強的自我更新復制、增殖和多向分化的生物特性。20世紀以來，科學家利用BMSCs的這些生物特性，將其用于基礎醫學科研和臨床應用中的研究已經越來越廣泛，并且也取得重要進展。本文就BMSCs的生物特性、分離培養、基礎科研和臨床應用等方面的研究進展進行綜述，重點介紹了BMSCs在骨科疾病、心血管科疾病、肝硬化以及椎間盤退變等治療方面的研究，通過對這些治療方案與技術的回顧，進一步探討BMSCs在基礎醫學以及臨床治療領域的用途，為深入BMSCs的基礎醫學科研和臨床應用方法提供一定的參考。

【關鍵詞】骨髓間充質干細胞；誘導分化；分離培養；臨床應用；基礎研究；綜述

前言

近年來，國內外對于骨髓間充質干細胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells,BMSCs）的研究越來越深入，開始進入了白熱化的過程，BMSCs在基因、組織工程和臨床治療上的應用也應運而生，這為BMSCs的基礎研究及其臨床疾病治療方法提供了新的思維［l］。BMSCs作為一種中胚層干細胞，具有極強的自我更新以及增殖分化的潛能，是干細胞家族中的重要成員［2］。因BMSCs具有免疫源性低、方便取材、來源廣泛、無道德倫理問題的限制、易于工業化制備等優點，在組織工程的研究中被認為是最為理想的種子細胞，常常被應用于細胞組織移植、基因治療等領域的研究［3］。通過將BMSCs與細胞移植、基因治療等技術結合起來，為科研與應用創造出了不少新的成果，也為將來進行BMSCs移植以及臨床治療提供了有效的經驗與手段。

lBMSCs的生物特性

BMSCs在干細胞家族中，是一類能夠從骨髓中分泌出多種不同類型細胞因子的原始骨髓基質細胞，同時是能夠在培養的過程中展現出強大的自我更新、高度的增殖分化能力的細胞群體。BMSCs的主要來源是骨髓，但在組織器官中也能獲取，同時，它具有基質細胞的特性，具有支持造血的功能，在不同的培養條件下，能夠高度增殖分化，并且通過誘導可以分化成骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經等組織細胞［4］。對于正常的BMSCs，可設置不同的誘導環境，能夠將其誘導分化成破骨細胞、脂肪細胞和神經細胞等，并可使其在多種細胞系中轉化［5-6］。BMSCs強大的自我更新和高度增殖能力，能夠使得原代BMSCs在接種24h內貼壁并呈集落狀生長，集落交界處隨著細胞生長，會出現重疊、融合，隨著培養時間的延長，BMSCs會繼續增殖生長，并在增殖傳代至第二代及之后，呈現為長梭形的細胞結構形態，并呈單層排列方向繼續生長［7］。基于BMSCs的這些生物學特點，其基礎醫學研究及其轉化醫學研究已經成為當前國際上備受關注的領域之一，并能夠在臨床治療和基礎研究中發揮重要作用［8-l0］。

2BMSCs的分離提取與鑒定

在完成每一項與BMSCs相結合的組織工程研究過程中，都需要具備數量充足的BMSCs。雖然BMSCs主要來源于骨髓，但其存在于骨髓中的含量極少，且所占單個核細胞中的比例也僅不到十萬分之一［ll］。從哺乳動物的骨髓中分離和提取BMSCs的過程非常難，BMSCs的數量也會隨著動物的年齡增長而逐漸減少。因此，要獲取充足數量的BMSCs必須獲得高純度、高活性以及生物性能均一的體外分離培養、擴增技術［ll-l2］。當前，主要有4種較為常用的體外分離、提純BMSCs的方法，包括全骨髓貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法、免疫磁珠法。其中前兩種方法操作較為簡易、快捷，提取出來的細胞純度較高，且實用性強，對細胞活性的影響也較小，是較為理想的分離純化方法［l3-l4］。而后兩種則由于其操作復雜、價格昂貴、實用性不強且對細胞活性影響較大，往往不作為最佳的分離純化方法［3,l5］。近幾年來，在BMSCs的提取純化上，有學者研究細胞篩選法以及紅細胞裂解法對細胞BMSCs進行提取以及純化。于發美［l2］在研究中發現，根據細胞的大小來進行分離的細胞篩選法，是通過3μm孔徑大小的培養皿，將BMSCs從骨髓中篩選出來。這一方法具有操作簡易、生物特性均一的優點。而Peterbauer-Scherb等［l6］則發現，通過向骨髓液中加入紅細胞裂解液，能夠將骨髓液中所含的大量紅細胞進行裂解，隨后再在全骨髓貼壁篩選法的基礎上進行提取與純化，減少貼壁的紅細胞及血小板數量，為BMSCs提供更多的空間，從而提高純化BMSCs的效率，獲得純度更高的BMSCs。從骨髓中提取的BMSCs雜合了多種細胞的細胞群，即使來源一致，但無法明確所提取的細胞中BMSCs所占比例。因此，在實驗過程中，對BMSCs做鑒定是極其必要的。目前，BMSCs的鑒定內容主要包括對其形態學特征、表面抗原、超微結構及多向分化能力等的檢驗［l6］。BMSCs是一種貼壁生長的細胞，形態為長梭形，并且具有很強的增殖能力［l7］。現在有很多研究報道，BMSCs的表面抗原標志具有非專一性的特征，主要包括了CDl06、CD34、CD36、CD7l、CD29等，但是到目前為止，還沒有發現具有BMSCs特異性的表面抗原標志［l8-2l］。

3BMSCs的臨床治療研究

3.lBMSCs在骨科疾病治療中的研究

骨折、股骨頭壞死，軟骨缺損等疾病是骨科中最常見的病種，盡管目前治療這些疾病的技術方法日新月異，但治療后的效果仍然不能讓人十分滿意，且費用偏高［22］。由于BMSCs具有取材方便、來源廣泛、增殖分化能力極強等特點，同時BMSCs對于軟骨、肌腱、以及骨的修復和再生等方面有強大的作用［23］，因此BMSCs在骨科疾病的治療上具有廣大的應用前景。近年來，國內外不少專家學者和骨科醫生，用自體BMSCs作為種子細胞與其他材料相結合，共同植入實驗動物體內，并應用于臨床治療軟骨缺損、脊神經損傷、股骨頭壞死等骨科疾病，并取得很多成果［2,24］。例如，Tali等［25］將人BMSCs作為主要的修復材料，利用組織工程技術將BMSCs種植于具有生物活性的材料上，體外培養構建出成軟骨，再將其植入裸鼠體內，最終得到了理想的軟骨效果。Kim等［26］也利用BMSCs的生物特性，把人BMSCs和提前礦化好的絲支架結合起來，組建形成組織工程骨并進行體外培養，結果顯示人BMSCs能夠在絲支架上發生良好的增殖和成骨分化。利用BMSCs作為骨組織缺損修復材料的方法，不僅能夠避免修復材料在生物源性上的缺陷，也能夠制備出具有良好生物相容性、骨傳導性的支架，促進骨缺損的修復［27］。關節軟骨被覆在關節表面，具有減震、潤滑以及緩解壓力等重要作用，但其自身組織缺乏血運，一旦出現缺損，其自愈能力十分有限［28］。BMSCs因其增殖分化能力極強，國外研究者Caplan等［29］利用適當數目的自身BMSCs移植到支持載體上，將其制作成全層軟骨損傷模型，并將其植入兔的膝部股骨踝處，經數周后的檢測和觀察發現，新合成的關節軟骨長出，并且達到修復損傷的效果。股骨頭壞死（ONFH）是目前骨科中常見的疾病，隨著研究的發展，許多結果都顯示，BMSCs的復制能力在治療ONFH的過程中發揮著重要的作用［30］。Li等［3l］在其實驗研究中發現，同時對PPARc進行下調，對CGRP進行上調，對于抑制BMSCs的脂肪增殖以及其骨形成是有促進作用的，這一發現對于預防ONFH是一種新的方法。除此之外，利用BMSCs進行移植治療骨折不愈合與傳統治療方法相比也頗具優勢。Hernigou等［32］研究者通過將BMSCs進行濃縮移植技術，對骨折不愈合患者進行治療，結果獲得成功。

3.2BMSCs在心腦血管疾病治療中的研究

隨著人們消費水平的提高以及生活方式的改變，心腦血管疾病的發病率也不斷增加。目前，BMSCs治療心腦血管疾病的效果也開始得到動物實驗以及臨床實驗的證實。科學家們利用BMSCs的生物特性，針對心腦血管疾病對受損組織進行再生性治療、增強神經營養因子分泌、分化，且在這一領域獲得一定的效果［33-34］。有研究者在2009年的一項臨床實驗中，將BMSCs以靜脈注射的方式對急性心肌梗死的患者進行治療，結果并沒有顯示并發癥，且癥狀有所緩解［35］。Bang等［36］把BMSCs移植到缺血腦卒中患者體內，并將這些患者隨機分為試驗組和對照組，最終的試驗結果為支持BMSCs提供移植治療腦血管疾病提供了有力數據。除此之外，德國羅斯托克大學醫學院成功利用BMSCs的細胞療法，為一名心肌梗死患者進行了靜脈輸注自體BMSCs治療，術后該患者心功能得到明顯改善［37］。這些成功的試驗研究成果為BMSCs治療心血管疾病提供了數據支持，并促進干細胞在臨床治療的研究不斷深入。

3.3BMSCs在肝硬化治療上的研究

肝硬化是臨床常見的一種由不同病因引起的良性終末肝病，它的治療原則是保存殘存肝部的支持治療，最理想的治療方法是肝臟移植，然而肝臟移植的來源十分有限，且價格昂貴［38］。采取自體BMSCs移植治療則是一種新興的治療手段，為肝硬化病人帶來新的希望［39］。BMSCs經過純化分離后，將其移植入肝臟，在誘導因子的作用下，能夠繼續分化形成具有功能的肝細胞，這些分化所得的肝細胞為肝硬化治療提供了一種新的途徑。Jung等［40］通過臨床試驗證明了BMSCs對改善患者凝血功能、降低膽紅素以及增加近期生存率有一定的促進作用，這就說明BMSCs是肝臟移植的理想種子細胞。劉黎等［4l］也同樣在臨床治療上使用了自體BMSCs移植的方法，通過自體骨髓分離純化提取BMSCs，經肝動脈移植治療的l9例肝硬化患者中，有l4例癥狀明顯改善，獲得良好的療效。Peng等［42］將527例肝硬化患者進行分組對照研究，通過自體BMSCs移植最終獲得良好的近期效果，且并未出現明顯的副作用。

3.4BMSCs在椎間盤退變治療上的研究

椎間盤退變是一種常見的臨床疾病，病情嚴重時會導致下腰痛進而影響到患者的日常生活。傳統的治療方法雖然在一定程度上能夠緩解椎間盤退變所造成的的腰痛，但因其局限性，會發生諸多并發癥。細胞治療的方法已經逐漸被廣泛研究，其中以BMSCs為種子細胞進行治療的臨床研究已取得巨大飛躍［43-44］。有研究證明，BMSCs在某一特定支架上進行培養，4周后膠原-II的數量明顯增多，這為BMSCs修復椎間盤纖維環提供了數據支持［45］。20l0年Yoshikawa等［46］首次通過自體BMSCs移植進行椎間盤再生治療，患者在術后腰腿疼痛緩解，2年后通過醫學影像技術進行檢查，發現其髓核內真空現象消失，且沒有不良反應。國外學者Orozco等［47］也使用同樣的方法對l0例患者進行了移植治療，結果顯示其中9例患者的癥狀得到改善與緩解。通過組織工程與BMSCs相結合的方式，為移植治療椎間盤退變提供了新的治療手段，是促進細胞療法深入研究與發展的重要推動力。

4BMSCs的基礎應用研究

除了將BMSCs應用于臨床疾病治療，近些年來，BMSCs在組織工程、誘導分化、表觀遺傳調控和細胞轉化等方面的基礎科研也有不少的研究成果。隨著對BMSCs的了解與研究，人們已經能夠利用其誘導分化成成軟骨的生物特性應用于組織工程中［48］。例如Yan等［49］將絲素蛋白和納米碳酸鈣層進行結合，構建出新型的多孔雙層支架，并將兔BMSCs種植到支架內，共同植入兔膝關節缺損處，數周后觀察發現復合支架與骨組織緊密貼合，并可見大量軟骨下骨向內生長并有血管生成，說明該雙層支架對于軟骨缺損有修復作用。BMSCs也能夠作為種子細胞，利用其誘導分化的生物特性，創造一定的誘導培養條件，促進缺損牙槽骨的修復。據報道，將BMSCs與富血小板血漿、纖維蛋白膠等共同進行體外培養，數周后所形成的膜片對于牙槽骨缺損修復具有良好的效果［50-52］。因BMSCs具有的多向分化能力，利用其分化干細胞也在臨床應用中越來越多，使得BMSCs在細胞替代治療和基因治療中的價值不斷凸顯。有研究報道，通過某些營養因子能夠利用其抗氧化作用調節BMSCs增殖相關的基因表達量，以促進BMSCs向神經元和血管內皮細胞等的分化［53］。除此之外，表觀遺傳學對BMSCs的調控作用，也會使得BMSCs在骨、神經、肌肉、血管等損傷修復方面的作用受到影響［54］。BMSCs在細胞工程、組織工程以及基因工程上的研究應用已經成為熱點，將極大地促進再生醫學的發展，為臨床醫學帶來巨大的應用價值。

5問題與展望

如今，BMSCs相關的基礎科學研究以及臨床應用正在醫學與生命科學的領域中大放光彩，關于BMSCs的研究也有了突飛猛進的發展。無論在細胞基因層面的調控，亦或是對疾病的預防和治療，BMSCs在不斷地用各種形式幫助人們攻克難題、創新技術。目前，國內外對于BMSCs在組織工程支架的研究不斷深入，通過將BMSCs與細胞基因、組織工程相結合，能夠制備出理想的細胞生長環境，幫助BMSCs在體外三維生物微環境中進行增殖分化，調控基因表達，促進BMSCs的增殖分化，為臨床治療方法提供更大的動力與來源。盡管目前人們對于BMSCs的研究獲得了很大的進展，但在BMSCs的分離純化、鑒定方面仍然不夠理想，未能完全篩選出BMSCs特有的標志分子，并且還需要建立一套完整的鑒定和培養BMSCs的統一標準。因此，在實際的臨床應用時還存在一定的難度。相信隨著研究方法的不斷探索與更新，這些問題會得到解決，BMSCs作為醫學與生命科學領域的理想種子細胞，將會為臨床多類疾病的治療提供廣大的應用前景。

作者：李婷 陳莉智 黃文華 單位：南方醫科大學基礎醫學院人體解剖學國家重點學科