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作者：吳小榮呂超李曉飛韓慶玲王杰易宗春單位：北京航空航天大學生物與醫學工程學院

鉛是常用的金屬材料，過量攝入鉛會引起造血系統的損害，從而引起的血紅蛋白(Hb)下降、紅細胞壓積和/或紅細胞滲透脆性降低，以及骨髓紅系克隆形成單位CFU-E的形成能力降低等嚴重的紅系方面的變化［2-3］。但是，關于鉛離子造血毒性的機制目前尚有許多方面并不明確。K562細胞是Lazzio等在1975年建立的人類慢性髓系白血病細胞系，在一些誘導劑作用下可向紅系和巨核系等方向分化，具有造血祖細胞的特點，是目前研究造血細胞增殖分化機制的常用模型。實驗研究了鉛離子在無明顯細胞毒性的濃度范圍內對K562細胞紅系分化的影響，為進一步研究鉛離子的紅系血液毒性的細胞分子機制提供了一定的實驗依據。

1材料與方法

1.1材料K562細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心;RPMI1640培養基(美國Invitrogen公司);胎牛血清(FBS，美國HyClone公司);醋酸鉛(北京益利精細化學品公司);FITC-IgG和FITC-anti-humanCD71(美國Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養:K562細胞培養在體積分數為10%的FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養。

1.2.2胎盼藍染色檢測細胞活性:將對數生長期K562細胞以一定濃度接種于24孔板中培養12h后按照一定梯度加入不同濃度的鉛離子在每一列孔中，每個濃度組4個平行。24、48和72h之后分別取出一定細胞，加入胎盼藍染液染色5min，紅血球記數板計數活細胞濃度，每個樣取3次記數。計算出各濃度組相對于溶劑對照組的相對活力，相對活力(%)=100×各濃度組活細胞密度/溶劑對照組活細胞密度。

1.2.3聯苯胺染色檢測Hb合成:選用指數生長期的K562細胞，以1×105個/ml的細胞濃度接種于24孔培養板中，在37℃、5%的CO2培養箱中培養12h后，實驗組分別加入終濃度為0、10、20和30μmol/L的鉛離子，同時加入40μmol/L氯化高鐵血紅素(Hemin)，然后重新置于培養箱中避光培養。48h后收集細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，制備成細胞懸液，加入1/5體積的聯苯胺－H2O2顯色液(含質量體積分數為0.2%的聯苯胺、0.5mmol/L冰乙酸，臨用時加入50mmol/LH2O2)，顯色10min，染色后細胞用紅血球計數板在光學顯微鏡下計數500個細胞中Hb陽性(藍染)細胞數，計算Hb陽性細胞比例。

1.2.4流式細胞術檢測K562細胞表面轉鐵蛋白受體CD71蛋白的表達:將對數生長期K562細胞以2×105個/ml的濃度接種于24孔板中培養12h后，加入30μmol/L鉛離子處理48h后離心收集細胞。用PBS-B(含1%BSA的PBS，4℃放置預冷)洗1次，再加入PBS-B重懸沉淀，然后加入FITC標記的CD71抗體5μl，混勻，避光4℃孵育30min;離心細胞，用PBS洗2次;上流式細胞儀進行檢測。根據幾何平均熒光強度計算出鉛離子處理細胞的相對熒光強度(RFI)，RFI=金屬離子處理樣品幾何熒光強度/對照樣品幾何熒光強度。

1.3統計學方法使用SPSS13.0進行分析，實驗數據以x珋±s表示，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1鉛離子對K562細胞的生長抑制作用不同濃度的鉛(醋酸鉛，10～50μmol/L)離子處理K562細胞24、48和72h后，用胎盼藍染色排除法檢測細胞活性狀況。結果發現，鉛處理的細胞的活細胞數量出現濃度依賴的降低(圖1A)，受處理細胞的死細胞比例與對照組相比并沒有太大變化(均在5%以內)。顯微鏡下觀察，細胞經鉛處理后視野內細胞數量明顯少于對照組細胞，形態沒有明顯變化(圖1B和1C)。結果表明，鉛離子對K562的細胞生長有較為明顯的抑制作用，但無直接導致細胞死亡的細胞毒性。

2.2鉛離子抑制Hemin誘導的K562細胞的Hb合成(紅系分化)K562細胞用40μmol/LHemin誘導紅系分化的同時加入不同濃度的鉛離子，處理48h后收集細胞應用聯苯胺染色法計數Hb陽性細胞分析鉛離子處理K562細胞的紅系分化情況。由表1可見，鉛離子對Hemin誘導的K562細胞紅系分化有較明顯的濃度依賴抑制作用，鉛離子各濃度組的紅系分化抑制率分別為6.10%、8.91%和15.74%。

2.3K562細胞經鉛離子處理后細胞表面CD71蛋白的表達變化應用免疫熒光標記抗體結合流式細胞術分析K562細胞經鉛離子處理后細胞表面轉鐵蛋白受體(CD71)表達水平。結果發現，K562細胞表面CD71的表達水平在經30μmol/L鉛離子處理48h后增加19.0%(圖2)。

3討論

首先觀察了鉛離子對K562細胞的毒性作用，結果發現鉛離子在10～50μmol/L濃度范圍內濃度依賴性的抑制細胞的活性;但是從細胞死亡率看，與對照組比較并沒有明顯的提高;而且，在顯微鏡下直接觀察發現除細胞數量明顯減少外，細胞形態與對照細胞比較也沒有明顯變化，沒有表現出細胞死亡的形態特征。這提示在目前所用的濃度范圍內，細胞數量的明顯減少并非鉛離子的直接細胞毒作用(細胞死亡)，而可能是抑制了細胞的增殖過程。Sarkar等的研究發現，醋酸鉛能抑制K562和HeLa細胞的增殖，并且上調細胞血紅素調節eIF-2α激酶(HRI)的表達和活性，因此，醋酸鉛引起細胞增殖抑制可能是由于HRI的表達與活性上調而抑制蛋白質合成而引起的。

進一步觀察醋酸鉛處理K562細胞誘導紅系分化的情況。結果顯示鉛離子濃度依賴性抑制K562細胞在Hemin誘導下向紅系分化。人紅系祖細胞(BFU-E)在暴露醋酸鉛14d，表現出明顯的紅系造血抑制作用，其中1mmol/L可以完全抑制Hb合成。而有研究更是發現，BFU-E對鉛(硝酸鉛)的敏感性顯著高于髓系CFU-GM，IC50分別是3.31μmol/L和63.58μmol/L。鉛已經被公認可以通過抑制血紅素合成過程中的ALAD和血紅素合成酶的活性而抑制血紅素合成。GATA-1是調節紅系分化的特異性轉錄因子。有研究顯示，鉛可以取代GATA-1的鋅指結構域中鋅而影響其轉錄調節活性。這提示，鉛可以通過調節紅系特異性相關基因的轉錄活性而抑制紅系分化。作為金屬離子，鉛可能會干擾鐵離子轉運過程，鐵是合成血紅素重要成份，因而也會影響血紅素的合成。研究結果顯示鉛離子處理的細胞表面CD71表達有一定程度增加，提示由于非Fe金屬離子的存在，可能會競爭性造成細胞內Fe水平降低，進而通過CD71基因非編碼區的鐵反應元件來調節CD71的表達。總之，實驗觀察到鉛在沒有表現出明顯的直接細胞毒性的濃度下可抑制Hemin誘導的K562細胞紅系分化，雖然血紅素合成是造成紅系造血重要機制，但并沒有排除其他方面機制的存在，K562細胞可用于研究這種金屬離子的紅系造血抑制作用的相關機制。