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1材料與方法

1.1Δ133p53、p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax和CyclinB1mRNA表達的nRT-PCR檢測取對數生長期細胞，均勻接種于六孔板中，分別加入0、50IU/ml、100IU/ml濃度的rmhtnf，培養24h后收集細胞。用Trizol試劑提總RNA，紫外分光光度儀檢測mRNA濃度和純度，M-MULV第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉錄，PremixTaqPCR擴增。BIO-RADMyCyderPCR儀中反應條件為94℃預變性5min，1個循環；94℃變性30s，56～58℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環；72℃延伸10min，1個循環，反應體系為25μl（引物序列見Table1）。PCR產物各5μl在2％瓊脂糖凝膠上電泳100V、20min，溴乙錠（EB）染色。BioSpectrumAC凝膠成像分析系統觀察nRT-PCR結果。

1.2統計學處理采用SPSS17.0軟件，各組實驗數據以x±s表示，各組間差異采用單因素方差分析，然后兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩變量間相關性采用Person直線相關分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1rmhTNF對MKN45增殖的影響不同濃度rmhTNF（50、100、200、400、500IU/ml）作用于MKN45細胞24h后，細胞抑制率，分別為23.180%±10.172%，37.219%±5.350%，48.665%±4.502%，59.830%±6.949%和70.388%±6.322%，提示rmhTNF對MKN45抑制率隨濃度增加而增加（F=35.683，P<0.001）。rmhTNF（50IU/ml）作用于MKN45細胞24、48、72h后，細胞抑制率分別為23.180%±10.172%，57.082%±4.045%，68.196%±4.108%，可見rmhTNF對MKN45細胞抑制率隨時間增加而增加（F=60.328，P<0.001）。

2.2不同濃度rmhTNF對Δ133p53、p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax和CyclinB1mRNA的影響rmhTNF（0、50、100IU/ml）作用于MKN45細胞24h后，nRT-PCR結果顯示MKN45細胞Δ133p53、Mdm2、CyclinB1mRNA的表達量隨濃度增加而降低(P＜0.05)，p53、Gadd45α、PTEN、BaxmRNA的表達量隨濃度增加而增加(P＜0.05)，見Table2，Figure1。

2.3MKN45細胞中Δ133p53與p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax、CyclinB1mRNA表達相關性MKN45細胞中隨rmhTNF作用濃度增加，Δ133p53、Mdm2、CyclinB1相對表達呈量遞減趨勢，p53、Gadd45α、PTEN、Bax相對表達量呈增長趨勢。Pearson直線相關分析結果顯示，MKN45細胞Δ133p53表達水平與p53、Gadd45α、PTEN、Bax表達水平呈負相關（r=-0.916，P<0.01；r=-0.894，P<0.01；r=-0.872，P<0.01；r=-0.971，P<0.01），與Mdm2、CyclinB1表達水平呈正相關（r=0.924，P<0.01；r=0.943，P<0.01），見Figure2。

3討論

胃癌的發生是多種因素共同作用的結果，p53功能失活在胃癌的發生、發展過程中起重要作用。p53基因突變已有研究，但其作用機理尚未完全闡明，p53異構體的發現為胃癌發生機制的研究提供了新方向。近年來，有關p53異構體和人類腫瘤關系的研究不斷增多，發現Δ133p53、Δ40p53異構體促腫瘤生長，p53β、p53γ抑制腫瘤生長。Δ133p53是第4內含子的內部啟動子的選擇性剪接，導致p53蛋白氨基末端截短［9］。本課題組前期研究中，張紅梅等發現，Δ133p53mRNA的表達率在正常癌旁組織→淺表性胃炎→慢性胃炎→胃腺癌中逐步上升，具有顯著性差異，提示胃癌的發生過程伴隨著異構體的動態變化。Wei等研究結果證明，Δ133p53在幽門螺桿菌感染相關胃炎→胃癌過程中起誘導因子作用。這些結果提示，研究Δ133p53異構體的功能和生物學效應，對于理解胃癌的發生發展具有重要的價值。本實驗結果顯示，rmhTNF對MKN45胃癌細胞系的抑制率與Δ133p53mRNA的表達率相反，且隨細胞抑制率增加Δ133p53表達率升高。既往研究發現，Δ133p53與野生型p53具有拮抗作用，通過抑制p53的功能，而抑制細胞凋亡。Sabour等研究表明，p53可激活并上調Gadd45基因，Gadd45通過與Cdc2形成復合物，導致Cdc2/CyclinB1復合物解離，從而細胞周期G2/M期阻滯，同時下調CyclinB1基因。研究證實，胃癌中突變型p53的表達較胃炎組織明顯升高，而PTEN下降，提示突變型p53蛋白升高可能阻礙PTEN蛋白的表達。Bax基因是一種促凋亡基因，Marcel等通過熒光素酶實驗研究表明，共轉染Δ133p53和FLp53異構體之后，作用于Bax啟動子可抑制p53的轉錄表達。以上研究表明，p53基因的生物學功能與Gadd45α、CyclinB1、PTEN、Mdm2、Bax表達密切相關。本研究結果發現，Δ133p53表達水平與p53、Gadd45α、PTEN、Bax表達水平呈負相關，與Mdm2、CyclinB1表達水平呈正相關，進一步驗證了Δ133p53對野生型p53的調控作用，這種調控體現在對下游分子Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax、CyclinB1的選擇性啟動，提示rmhTNF對MKN45胃癌細胞系的抑制可能與該機制有關。由此可見，Δ133p53可能是rmhTNF治療胃癌生物學效應的關鍵靶點，為胃癌診斷、治療、以及預后研究提供依據。

作者：姜琪琪 張娜 郭愛 李偉 張紅梅 季萬勝 單位：濰坊醫學院 濰坊醫學院附屬醫院